基于蛋白质组学技术和miRNA表达谱技术的缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤作用机理研究

论文摘要

缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）可以启动某些内源性的保护机制,减轻肝脏缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤,但IPC具体的保护机制目前尚未完全明确。本研究将筛选合适的对C57BL/6小鼠肝脏I/R损伤运用有保护作用的IPC方案,运用蛋白质组学的研究方法,旨在分析IPC对肝脏I/R损伤后蛋白表达的影响并进一步寻找其可能的机制,以及运用miRNA表达谱技术,大规模检测肝脏I/R损伤过程和IPC处理措施对肝脏miRNA表达的变化,探讨其变化规律,揭示其内在联系,为深入认识IPC的保护机制提供理论依据。第一部分不同缺血预处理方案对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响方法将56只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、I/R组和缺血2 min/再灌注10 min（IPC2/10组）、缺血5 min/再灌注10 min（IPC5/10组）、缺血10 min/再灌注10 min（IPC10/10组）、缺血15 min/再灌注10 min（IPC15/10组）、缺血20 min/再灌注10 min（IPC20/10组）和缺血30 min/再灌注10 min（IPC30/10组）等6种不同IPC方案每组7只;比较各组小鼠肝脏I/R后血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶及肝脏病理学变化,以判断肝脏损伤情况并由此比较不同方案的IPC对肝脏I/R损伤的影响。结果I/R组血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶明显高于假手术组（分别为2547.1 U/L±307.1 U/L比97.9 U/L±9.4 U/L,2814.3 U/L±187.6 U/L比481.6 U/L±36.8 U/L,均有P＜0.01）;肝脏病理学改变也明显重于假手术组,主要表现为严重的肝窦淤血、肝小叶结构紊乱等。与I/R组相比,方案为缺血10min/再灌注10min的IPC10/10组的血清丙氨酸氨基转移酶（1174.3 U/L±217.8 U/L）和天门冬氨酸氨基转移酶（1714.3 U/L±197.9 U/L）明显降低（均有P＜0.01）,肝脏病理学改变也明显改善;其余方案的IPC无明显的保护作用。结论不同方案的IPC对小鼠肝脏I/R损伤的影响存在差别,其中方案为缺血10min/再灌注10min的IPC可以明显减轻肝脏I/R损伤。第二部分缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤后蛋白表达影响的研究方法1、雄性SPF级C57BL/6小鼠、体重21-25g,购白海斯莱克实验动物有限责任有限公司[实验动物许可证号:SCXK（沪）2003-0003]。于浙江省医学科学院实验动物中心屏障系统实验室饲养[实验动物许可证号:SYXK（浙）2003-0001]。实验前适应性饲养1周,术前12小时开始禁食但不禁水。2、将所有小鼠按体重随机分为假手术组（n=6）、缺血再灌注组（n=6）、缺血预处理组（n=6）。相应处理如下:假手术组:麻醉、开腹、局部组织游离、关腹,但不阻断肝脏血流。缺血再灌注组:予以肝左叶和中叶缺血75分钟/再灌注120分钟。缺血预处理组:在肝左叶和中叶缺血75分钟之前,预先给予缺血10分钟/再灌注10分钟的缺血预处理,而后操作同缺血再灌注组。3、观察各组术后血清ALT、AST,肝组织于10%中性福尔马林固定后、常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、光镜观察肝脏病理学改变。并按Saidi等提出的肝脏病理评分标准,对肝脏损伤程度进行病理评分,具体标准如下:0度（正常肝脏）,即几乎没有肝脏损伤的迹象;1度（轻度）,包括胞浆空泡化、局灶性核固缩等;2度（中、重度）,包括弥漫性核固缩、肝细胞边界模糊、肝窦淤血明显等;3度（极重度）,包括严重的肝细胞坏死、肝索结构模糊、严重的肝窦淤血、中性粒细胞聚集等。4、分别将假手术组、I/R组、IPC组的肝组织置于液氮中,用液氮预冷的研钵研磨至粉末状,0.1g/管分装,充分裂解30min,40 000g 15℃离心1h去除不溶物质。小心吸取上清液,用Bradford法进行蛋白定量。从管中取出435μl复水液,加入蛋白样品15μl（约150μg）混匀,进行等电聚焦电泳,设置等电聚焦程序:30V*6h,60V*7h,200V*1h,500V*1h,1 000V*1h,8 000V*1.5 h,8 000V（60 000 V h）,500V*3h维持,聚焦结束的胶条,立即进行平衡;行SDS-PAGE电泳,设置电泳程序:S1:15mA/gel*1h,S2:30mA/gel。将电泳后的凝胶置于固定液（10%乙醇,7%乙酸）中2h,蒸馏水洗3次,将胶置于胶体蓝染液（0.12%考马斯亮蓝G250,10%硫酸胺,10%磷酸,20%甲醇）中2h,用蒸馏水脱色至点清晰。5、染色后的凝胶经imageScanner（GE healthcare）扫描,生成的图像文件在PDQuest软件中分析。每张胶图经自动点检测和手工校对后,以其中一张胶为master胶进行胶图之间的匹配。用student’s t-test筛选2倍以上有统计学意义的差异点。6、用解剖刀将差异蛋白点从胶上切下来,并切成1-2 mm2大小的胶片放入1.5ml离心管中;蛋白酶切和提取后,进行质谱鉴定。7、ATP5B蛋白和BHMT蛋白表达通过Western blot进行检测。8、采用反相离子对高效液相色谱法检测肝脏ATP含量。结果I/R组血清ALT、AST均明显高于假手术组（均有P＜0.01）;肝脏病理学改变也明显重于假手术组,主要表现为肝窦严重淤血、肝细胞肿胀等。与I/R组相比,IPC组血清ALT、AST明显降低（均有P＜0.01）,肝脏病理学改变也明显改善。缺血再灌注组的肝脏蛋白与假手术组比较,具有统计学差异的蛋白差异点,上调的蛋白有3个,下调的蛋白有20个;参与代谢的有13个,氧应激的有5个,信号通路的2个,及其它3个蛋白（详见表3）。IPC组的肝脏蛋白与缺血再灌注组的表较,上调的蛋白有8个,下调的蛋白有8个。参与代谢的有10个,氧应激的有1个,信号通路的3个,及其它2个蛋白（详见表4）。其中在2个过程中均有明显变化的是ATP合成酶亚单位B（ATP5B）、Betaine-homocysteine S-methyltransferase（BHMT）、Transthyretin（TTR）、Majorurinary protein 6（MUP6）等4个蛋白,其中I/R过程中ATP5B、BHMT和MUP6减少,TTR增加;反之,IPC组ATP5B、BHMT和MUP6增加,TTR减少。Western blot结果显示,与2-DE结果一致,I/R组肝脏ATP5B表达与内对照GAPDH的比值较假手术组明显下降（0.643±0.068 vs 1.525±0.063,P＜0.01）,而IPC组ATP5B表达（1.063±0.058）较缺血再灌注组明显上升（P＜0.01）。I/R组肝脏BHMT表达与内对照GAPDH的比值较假手术组下降（0.993±0.156vs1.636±0.381,P=0.167）,而IPC组ATP5B表达（1.382±0.285）较I/R组上升（P=0.247）。肝脏ATP含量变化趋势与ATP5B表达水平变化趋势一致,I/R组的肝脏ATP含量为17.04 ng/mg±0.85 ng/mg,与假手术组（23.39 ng/mg±1.16ng/mg）相比,差异具有非常显著性（P＜0.01）;与I/R组相比,IPC组肝脏ATP含量为22.59 ng/mg±2.02 ng/mg,差异具有显著性（P＜0.05）。结论1、肝脏I/R过程,上调的蛋白有3个,下调的蛋白有20个;IPC组的肝脏蛋白与I/R组的表较,上调的蛋白有8个,下调的蛋白有8个。2、IPC与I/R两个过程中均有明显变化的是ATP5B、BHMT、TTR和MUP6等4个蛋白,其中I/R过程中ATP5B、BHMT和MUP6减少,TTR增加;反之,IPC组ATP5B、BHMT和MUP6增加,TTR减少。3、IPC可能通过增加ATP5B的表达,使肝组织ATP的含量增加,从而发挥其肝脏保护作用。4、BHMT及其催化的甲基代谢可能在IPC对I/R损伤的保护机制中发挥着重要作用。5、TTR可能在I/R损伤和IPC中发挥重要作用。第三部分缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤后miRNA表达谱影响的研究方法1、肝脏标本的制备具体过程详见第二部分的缺血再灌注损伤和缺血预处理保护作用的肝脏制备,每组随机选择3个样本进行miRNA表达检测。2、分别将假手术组、I/R组、IPC组的肝组织置于液氮中,取出黄豆大的肝脏组织样品,加入1ml的TRIZOL试剂,进行匀浆,将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中,加入200μl氯仿,振荡混匀;将离心后上清液移至一新Eppendorf管中,加入500μl异丙醇,轻轻混匀,室温静置15min;离心后倒掉上清液,加入1ml 75%乙醇,振荡混匀;再次离心后倒掉上清液,并在超净台中将乙醇挥发干净;加入40～60μl DEPC H2O,65℃5min助溶;紫外吸收法测定RNA浓度和纯度,1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量;样品于-70℃冷冻保存。3、用miRCURYTM Array Labelling kit标记miRNA,并采用RNeasy MiniKit浓缩标记样品。用miRCURYTM Array microarray kit进行miRNA芯片杂交,使用Genepix 4000B进行图像扫描,使用635nm激发。图像存成TIF文件,使用Genepix Pro 6.0分析数据,分析结果导出,最终用EXCEL文件表示。4、由Axon microarray scanner扫描并由genepix Pro软件读值获得各个点的原始信号值和减掉背景的修正值。在每张芯片上,修正值都＞=50,且非control的探针做标准化,求这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理获得各个点的标准值,应用标准值进行相互比较获得差异表达探针。去除可能不可信的属于不准确数值结果即修正值＜50的探针。用student’s t-test筛选有统计学意义差异的信号标准值。5、分别将有统计学意义的差异表达miRNA,用miRanda对其进行靶基因的预测,把预测的靶标合并,提交GOTermfinder（http://go.princeton.edu/）进行GO显著性分析。用TargetScan和PicTar等预测软件预测靶基因,并在网络上比对搜索有明确生物学意义调控的靶基因,并行聚类分析,建立基于基因功能的模块。结果1、与假手术组比较,I/R组的肝脏miRNA表达上升的有47个,下降的有58个;而IPC组的肝脏miRNA与I/R组相比,下调的有10个。2、功能分析提示,这些miRNA参与了生物调节、细胞进程、发育过程、定位的建立、代谢过程等病理生理过程。3、mmu-miR-346MM1、miRPlus17905、mmu-miR-370、mmu-miR-326和mmu-miR-23a等5个miRNA在肝脏I/R损伤和IPC时发生了相反的变化（在I/R损伤后表达上调,经IPC处理后又下调）,主要的靶基因涉及DNA依赖的转录调控和转录两大块,其中以miR-370的变化最为显著。4、生物信息学分析提示,在差异表达的miRNA调控的基因中,差异表达的蛋白有TTR、HMGCS2、ALDH6a1、PNP1、ALDH1b1、ATP5B和Mat1a。其中调控ATP5B可能有mmu-miR-103、mmu-miR-23a和mmu-miR-503等至少40个miRNA,调控TTR可能有mmu-miR-210、mmu-let-7c mmu-let-7e等至少30个miRNA,调控HMGCS2可能有mmu-miR-140等至少6个miRNA,调控ALDH6a1可能有mmu-miR-711等至少11个miRNA,调控PNP1的miRNA可能是mmu-miR-503,调控ALDH1b1可能有mmu-miR-382和mmu-miR-326等至少21个miRNA。结论1肝脏I/R损伤和IPC均涉及到众多miRNA表达的变化,这些miRNA参与了生物调节、细胞进程、发育过程、定位的建立、代谢过程等病理生理过程。2 miRPlus17905、mmu-miR-346MM1、mmu-miR-370、mmu-miR-326和mmu-miR-23a在肝脏I/R损伤和IPC时发生了相反的变化（在I/R损伤后表达上调,经IPC处理后又下调）,主要的靶基因涉及DNA依赖的转录调控和转录两大块。3 miR-370可能通过影响潜在靶标基因MAPKK3和MAPKK7的表达,并进一步调节MAPK信号转导通路的信号分子,由此在肝脏I/R损伤和IPC中发挥调节作用。4 ATP5B在肝脏I/R损伤和IPC过程中的表达可能受到mmu-miR-23amiRNA的调控。5在肝脏I/R损伤过程中,HMGCS2可能受到mmu-miR-140*的调控;ALDH6a1的表达可能受到mmu-miR-711的调控;PNP1的表达可能受mmu-miR-503的调控。6 ALDH1b1在肝脏IPC过程中的表达改变可能受到mmu-miR-326的调控。7 TTR在肝脏I/R损伤和IPC过程中miRNA的调控机制相对复杂,可能涉及一些miRNA网络调控的综合效应,或者未受到相应的miRNA的影响。

论文目录

• 一.英文缩写词对照表
• 二.中文摘要
• 三.英文摘要
• 四.正文
• 1.引言
• 2.第一部分 不同缺血预处理方案对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 参考文献
• 3.第二部分 缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤后蛋白表达影响的研究
• 1.缺血再灌注损伤和缺血预处理保护作用的肝脏制备
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 小结
• 2.差异蛋白的筛选和鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 3.部分差异蛋白的验证
• 3.1 部分差异蛋白质的Wresten blot验证
• 3.2 肝脏ATP含量检测
• 4.讨论
• 5.小结
• 参考文献
• 4.第三部分 缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤后miRNA表达谱影响的研究
• 1.肝脏样品获取
• 2.miRNA表达谱芯片实验
• 3.生物信息学分析
• 4.讨论
• 5.小结
• 参考文献
• 五.综述
• 六.附录
• 1.主要仪器和试剂
• 2.攻读博士学位期间相关学术成果
• 七.致谢