枸杞多糖的结构分析及生物活性评价

论文摘要

枸杞多糖作为天然多糖中的重要一员，在祖国的中医药中具有特殊的重要地位。本文在前人已有研究的基础上，继续开展枸杞多糖的提取、结构及生物活性的研究，并采用激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪、原位末端标记等生物学前沿技术从细胞凋亡角度探讨了枸杞多糖的抗肿瘤作用机制，同时提出了枸杞多糖新的分离程序及简便准确测定枸杞子水提物中多糖含量的方法。主要研究结果如下： 1 枸杞多糖的特性及结构表征 作者提出了枸杞多糖新的分离程序：枸杞子通过粉碎、提取分离、真空浓缩、脱色、脱蛋白、凝胶渗透色谱、冷冻干燥、纯度监测等程序，获得组分单一的精制枸杞多糖，得率2.21％（W／W）。 经检测，上述分离程序得到的精制枸杞多糖中含中性糖45.09％、蛋白质6.98％、半乳糖醛酸46.76％。气相色谱测得枸杞多糖的中性糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六种单糖组成，其摩尔比例为0.72∶5.82∶0.52∶0.26∶1∶4.48；由红外光谱图可知：枸杞多糖中含有-COOH、-OH和-NH2或-NH-基团，糖链中含有β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃半乳糖；β-消去反应证明多糖链和氨基酸间为-O-型连接；刚果红实验表明枸杞多糖不具有三股螺旋结构；碘-碘化钾反应表明枸杞多糖存在较长的侧链和较多的分枝；经扫描电镜观察，枸杞多糖表面呈松散的碎片状聚集态。 2 枸杞子水提物中多糖含量的测定 本文首次提出测定枸杞子水提物中多糖含量的简便方法。以不同溶剂去除枸杞子水提物中的单糖、低聚糖、色素等杂质后，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，测定波长为490nm，多糖换算因子f=3.26；在7～49μg／mL范围内，其浓度与吸光度线性关系良好，R2=0.9984；多糖的平均回收率为99.74％，RSD为1.83％（n=6）；测定枸杞子水提物中多糖的含量为3.86％；该方法简便、准确、重现性好，也可作为其它水提物中多糖含量的测定方法。 3 枸杞多糖与人宫颈癌HeLa细胞凋亡的关系 枸杞多糖具有诱导细胞凋亡的作用。噻唑蓝（MTT）实验证明在添加有枸杞多糖6.25mg／L～100mg／L的培养液中，人宫颈癌HeLa细胞的增殖受到显著抑制；细胞形态学观察（普通光学显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、透射电镜）发现，枸杞多糖可诱导HeLa细胞凋亡，细胞呈现典型的凋亡细胞形态；原位末端标记法表明枸杞多糖可使细胞凋亡指数显著提高。 流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜检测发现，枸杞多糖能将人宫颈癌HeLa

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1 枸杞及枸杞多糖的研究进展
• 1.1 枸杞的研究进展
• 1.1.1 枸杞的化学成分
• 1.1.2 枸杞的药理功能
• 1.2 枸杞多糖的研究进展
• 1.2.1 枸杞多糖的分离与分析
• 1.2.2 枸杞多糖的药理作用
• 2 课题构想
• 2.1 本科题研究目的意义
• 2.2 研究的主要内容
• 第二章 枸杞多糖的提取及组成分析
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 枸杞粗多糖的提取
• 1.4.2 Sevage法脱蛋白
• 1.4.3 多糖的纯化
• 1.4.4 枸杞多糖纯度的监测
• 1.4.5 中性糖含量的测定
• 1.4.6 蛋白质含量的测定
• 1.4.7 半乳糖醛酸含量测定
• 1.4.8 基本理化性质的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 枸杞多糖的Sephadex G-75色谱柱洗脱曲线
• 2.2 枸杞多糖纯度的监测
• 2.3 中性糖含量
• 2.4 蛋白质含量
• 2.5 半乳糖醛酸含量
• 2.6 基本理化性质
• 3 讨论
• 第三章 枸杞多糖结构的初步研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 紫外图谱测定
• 1.4.2 红外图谱测定
• 1.4.3 枸杞多糖单糖组成成分的测定
• 1.4.4 刚果红实验
• 1.4.5 β-消去反应
• 1.4.6 碘-碘化钾反应
• 1.4.7 枸杞多糖的扫描电镜观察
• 2 结果与分析
• 2.1 紫外光谱分析
• 2.1.1 枸杞多糖的紫外吸收光谱
• 2.1.2 不同外界因素对枸杞多糖紫外吸收光谱的影响
• 2.2 枸杞多糖的红外光谱
• 2.3 枸杞多糖的组成成分分析结果
• 2.4 刚果红实验分析
• 2.5 β-消去反应
• 2.6 碘-碘化钾反应
• 2.7 枸杞多糖的扫描电镜观察
• 3 讨论
• 第四章 枸杞子水提物中多糖含量的测定
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 枸杞多糖的提取与精制
• 1.4.2 标准曲线的绘制
• 1.4.3 换算因子的测定
• 1.4.4 样品中枸杞多糖的含量测定
• 1.4.5 重现性试验
• 1.4.6 稳定性试验
• 1.4.7 回收率测定
• 2 结果与分析
• 2.1 标准曲线的绘制
• 2.2 精制枸杞多糖的得率
• 2.3 换算因子
• 2.4 枸杞子水提物的得率
• 2.5 灰白色样品粉末的得率
• 2.6 枸杞子水提物中多糖含量的测定
• 2.7 重现性分析
• 2.8 稳定性分析
• 2.9 回收率测定
• 3 讨论
• 第五章 枸杞多糖对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞株
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 噻唑蓝法检测枸杞多糖对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用
• 1.4.2 MTT法检测枸杞多糖对正常细胞L929生长的影响
• 1.4.3 细胞形态学观察
• 1.4.4 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测细胞凋亡指数
• 1.4.5 流式细胞仪检测枸杞多糖对细胞周期的影响
• 1.4.6 激光扫描共聚焦显微镜检测细胞浆钙离子浓度
• 1.4.7 流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位
• 1.4.8 细胞培养液中一氧化氮含量的检测
• 1.4.9 细胞培养液中一氧化氮合酶及诱导型一氧化氮合酶活性的检测
• 1.4.10 细胞膜中唾液酸含量的测定
• 1.5 统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 枸杞多糖对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
• 2.2 枸杞多糖对正常细胞L929增殖的影响
• 2.3 形态学观察
• 2.3.1 人宫颈癌HeLa细胞可见光形态学观察结果
• 2.3.2 正常细胞L929可见光形态学观察结果
• 2.3.3 人宫颈癌HeLa细胞荧光显微镜形态学观察结果
• 2.3.4 人宫颈癌HeLa细胞的激光扫描共聚焦显微镜形态学观察结果
• 2.3.5 人宫颈癌HeLa细胞的透射电镜形态学观察结果
• 2.4 原位（缺口）末端标记法（TUNEL）检测结果
• 2.5 流式细胞仪检测细胞周期的结果
• 2.6 激光扫描共聚焦显微镜检测细胞浆钙离子浓度的结果
• 2.7 流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位ΔΨm的结果
• 2.8 细胞培养液中一氧化氮含量的检测结果
• 2.9 细胞培养液中一氧化氮合酶及诱导型一氧化氮合酶活性的检测结果
• 2.10 细胞膜中唾液酸含量的检测结果
• 3 讨论
• 第六章 枸杞多糖对小鼠移植性肝癌的作用
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 样品
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 小鼠饲料
• 1.5 实验动物
• 1.6 实验方法
• 1.6.1 动物实验分组及给药途径
• 1.6.2 肝癌动物模型制备及实验方法
• 1.6.3 检测项目
• 1.7 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 一般情况
• 2.2 枸杞多糖对荷瘤小鼠体重的影响
• 2.3 枸杞多糖对荷瘤小鼠的抑瘤作用
• 2.4 枸杞多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化的影响
• 2.5 枸杞多糖对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
• 2.6 枸杞多糖对荷瘤小鼠迟发型超敏反应的影响
• 2.7 枸杞多糖对荷瘤小鼠肝组织SOD和MDA的影响
• 2.8 肿瘤组织病理学观察
• 3 讨论
• 第七章 枸杞多糖对高脂血症小鼠血脂的调节作用
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 样品
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 小鼠饲料
• 1.5 实验动物
• 1.6 实验方法
• 1.6.1 动物分组
• 1.6.2 动物饲养及处理方法
• 1.6.3 检测项目
• 1.7 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 一般情况
• 2.2 枸杞多糖对小鼠体重的影响
• 2.3 枸杞多糖对小鼠血清总胆固醇的影响
• 2.4 枸杞多糖对小鼠血清甘油三酯的影响
• 2.5 枸杞多糖对小鼠血清HDL-C、LDL-C及HDL-C／TC的影响
• 2.6 枸杞多糖对小鼠肝组织中TC、TG的影响
• 2.7 枸杞多糖对小鼠肝组织中SOD、MDA的影响
• 2.8 枸杞多糖对小鼠内脏器官组织指数的影响
• 2.9 枸杞多糖对小鼠血脂水平的影响
• 3 讨论
• 第八章 结论
• 第九章 文献综述：一氧化氮与细胞凋亡
• 参考文献
• 致谢
• 附录一 图表目录（按先后顺序排列）
• 附录二 攻读学位期间发表论文