论文摘要
研究背景脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）是来自脉络膜血管的异常血管,位于视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）下间隙或神经上皮下间隙。CNV好发于黄斑区,其原因与脉络膜循环在黄斑区的生理学和解剖学特征有关。CNV可发生于许多眼底疾病,如年龄相关性黄斑变性（age related macular degeneration,AMD）,由于其管壁的高通透性,极易引起局部出血和渗出,继而形成瘢痕组织,严重影响视功能,甚至可致盲。在CNV发生过程中, RPE细胞起着重要的调控作用,脉络膜毛细血管内皮细胞是CNV发生的靶细胞。在正常状态下,两种细胞间存在着一个重要的屏障,即Bruch膜。此膜一旦遭到破坏,各种刺激因素可直接或通过RPE细胞间接作用于脉络膜毛细血管内皮细胞,诱发CNV。研究证实,CNV患者存在脉络膜血液循环的改变和Bruch膜的弥漫增厚,导致缺氧状态的产生。而缺氧可增强缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的表达和活性。Rac1参与了缺氧信号传导通路,其作用机制是通过调控HIF-1α的表达和活性来实现的。目前对于Rac1的研究主要集中在肿瘤方面,已明确Rac1蛋白几乎参与肿瘤形成的每个阶段如肿瘤发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程。在血管发生中,Rac1可调节细胞外基质和VEGF诱导的内皮细胞的趋触和趋化作用,促进内皮细胞的增殖、迁移,是VEGF受体后信号通路的一个重要中间分子。但是,关于其在缺氧的RPE细胞与CNV发病中的关系鲜有报道。目的:观察Rac1和HIF-1α在缺氧的人RPE细胞及小鼠CNV模型中的表达,探讨二者在CNV发生过程中的作用。方法:（1）在含有200μM CoCl2的培养液内分别培养人RPE细胞0、0.5、1、2、4、8、12和24 h,建立人RPE细胞胞内化学缺氧模型。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测缺氧不同时间Rac1和HIF-1α的表达。（2）用532nm激光诱导小鼠CNV模型,分别在光凝后1、3、7、14、28 d行荧光素眼底血管造影后处死小鼠,摘除眼球行病理切片观察及免疫组织化学检测Rac1和HIF-1α蛋白在CNV组织中的表达。结果:（1）RT-PCR结果显示:常氧状态下,RPE细胞内Rac1 mRNA表达呈阴性,缺氧早期RPE细胞内即有Rac1 mRNA的表达,且呈时间依赖性,缺氧4h达到高峰,与常氧组对照具有显著差异（P<0.05）;Western blot检测结果显示:常氧状态下RPE内未发现Rac1的表达,缺氧1 h可见弱表达,2 h明显上升,8 h达到高峰,随后开始下降。用Sigma Gel 1.0和Sigma Plot 4.0软件对Western blotting结果进行分析后显示:缺氧2、4、8和12 h组Rac1灰度分别是1 h组的2.1、3.2、3.8和2.8倍,经SNK-q检验后发现,2 h和12 h之间比较差异无统计学意义（P>0.05）,其余各组之间两两比较的差异均有统计学意义（P<0.05）;免疫细胞化学方法显示:缺氧条件下RPE细胞早期即有Rac1和HIF-1α的表达,Rac1主要位于胞浆,随着缺氧时间的延长,阳性表达量上调,在8 h达到高峰,12 h开始下降。与常氧组对照,具有显著性差异（P<0.05）,同Western blot检测结果相符。HIF-1α位于胞浆和胞核,缺氧12 h达到高峰,24 h下降。与常氧组对照,具有显著差异（P<0.05）。且二者表达呈显著正相关（r=0.985,P<0.05）。（2）激光诱导的小鼠CNV组织形成过程中均有Rac1和HIF-1α蛋白的表达,激光光凝早期二者表达均增高,激光照射后3和7 d均达到高峰,Rac1蛋白的阳性表达率分别为34.58%和53.35%,而HIF-1α蛋白的阳性率为33.05% and 50.35%。光凝14 d时二者的表达均下降,阳性率分别为25.50% and 31.97%,二者表达呈显著正相关（r=0.943 ,P =0.016）。结论:（1）Rac1和HIF-1α在早期缺氧的RPE细胞中呈瞬时高表达,可能与CNV的形成有关,且二者之间存在显著正相关性,Rac1的表达峰值早于HIF-1α的表达峰值,表明Rac1对缺氧的RPE细胞表达HIF-1α可能具有调控作用。（2）Rac1和HIF-1α在CNV组织中存在高表达,且二者表达密切相关,说明在CNV的形成过程中,Rac1和HIF-1α起着一定的作用。Rac1有可能成为早期CNV药物治疗的靶点。创新点:Rac1和HIF-1α在新生血管的生成中起着重要的作用,且二者在脉络膜新生血管形成早期呈显著相关,同类研究在国内外尚未见报道。
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