AAV载体介导的VEGF121基因的构建及其在HUVEC细胞体外表达的实验研究

论文摘要

目的:观察克隆构建的腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子基因(AAV-VEGF121)感染传代培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后对细胞的影响,研究VEGF121基因的体外促血管内皮细胞生长作用。方法:1、经RT-PCR 获取人VEGF 基因,克隆入载体质粒pAAV-MCS 中,构建成pAAV-VEGF121。2、脂质体共转染法在AAV-293 细胞中包装生成以LacZ 为报告基因的pAAV-LacZ 病毒颗粒;在相同条件下,包装生成pAAV-VEGF121病毒颗粒;经β-半乳糖苷酶染色检测转染效率。收集pAAV-LacZ 病毒原液,通过感染人纤维肉瘤细胞（HT-1080）,间接测得pAAV-VEGF121重组病毒的滴度。3、建立细胞模型:以pAAV-VEGF121病毒和空白载体pAAV-MCS 病毒分别感染传代培养的HUVEC,生成处理组和对照组。CCK-8 法测取OD450nm值,绘制细胞的增殖曲线;电子显微镜观察细胞超微结构的改变;半定量RT-PCR 检测细胞内VEGF121基因mRNA 的表达差异。结果:1、成功构建了rAAV-VEGF,经序列测定目的基因为VEGF121。2、经β-半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因LacZ 在HT1080 中的表达,测得重组病毒滴度为6.4×107个/ml,转染率为20%。3、两组HUVEC 的增殖曲线显示处理组细胞增殖能力明显高于对照组;透射电镜显示两组细胞均见多量溶酶体,处理组细胞内与蛋白质合成有关的细胞器增生明显活跃;半定量RT-PCR 示处理组细胞内VEGF121 的mRNA 表达水平高于对照组（P=0.000）。结论:携带人VEGF121的AAV 的滴度可以稳定地达到107个/ml 以上,以之感染体外传代培养的HUVEC 后,在多个方面均见明显差异。实验证实AAV-VEGF121基因对血管内皮细胞的生成具有促进作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 121基因克隆的构建'>第一部分 AAV-VEGF₁₂₁基因克隆的构建
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 121重组病毒颗粒的包装与滴度测定'>第二部分 AAV-VEGF₁₂₁重组病毒颗粒的包装与滴度测定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 121基因在HUVEC 细胞的体外表达'>第三部分 AAV-VEGF₁₂₁基因在HUVEC 细胞的体外表达
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述