论文摘要
目的:研究PNP基因的克隆、真核表达载体的构建与鉴定,为肿瘤的基因治疗与基因工程的应用提供实验和理论依据。方法:①大肠埃希氏杆菌K12 PNP基因的PCR扩增;②重组质粒pMSCV-PNP的构建;③用氯化钙法制备感受态大肠杆菌（XL1-Blue）;④转化感受态菌:用携带目的基因的重组质粒pMSCV-PNP转化感受态XL1-Blue大肠杆菌,同时设立阳性对照组和阴性对照组。转移适量转化菌于平皿培养,筛选氨苄青霉素抗性转化菌落;⑤提取质粒和酶切重组质粒:提取重组质粒pMSCV-PNP,限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ双酶切重组质粒,电泳鉴定;⑥PCR鉴定、测序鉴定重组质粒pMSCV-PNP;⑦提取质粒和酶切质粒:限制性内切酶BspHⅠ、BglⅡ、AflⅡ分别酶切pVSV-G,pGAG-POL,pMSCV,电泳鉴定质粒。结果:①PNP基因PCR扩增出特异条带;②重组质粒pMSCV-PNP电泳结果与预期一致;③重组质粒pMSCV-PNP转化结果:实验组平皿上可见近百个菌落,阳性对照组有数百个菌落生长,而阴性对照组则未见菌落生长;④阳性克隆质粒pMSCV-PNP PCR鉴定、酶切鉴定,电泳条带与预期一致;测序结果正常;⑤克隆质粒pVSV-G,pGAG-POL,pMSCV酶切鉴定与预期一致。结论:①从大肠埃希氏杆菌K12中克隆到PNP基因;②构建了表达载体pMSCV-PNP;③抽提了三种载体质粒pMSCV、pVSV-G、pGAG-POL。
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