鼠疫耶尔森氏菌新型候选DNA疫苗的构建及其免疫效果鉴定

论文摘要

鼠疫杆菌（Yersinia pestis）是腺鼠疫、败血症鼠疫和肺鼠疫的自然疫源性病原,曾经以“瘟疫”的形式给人类的健康造成了极大的危害,历史上共造成约2 亿人死亡,现在世界各地每年仍有鼠疫病例报道。由于生物恐怖袭击事件的发生,已引起世界各国对鼠疫的高度警惕。恐怖袭击常采用气溶胶感染,可直接引起原发性肺鼠疫流行,因而更需要研究安全有效的鼠疫疫苗。传统的鼠疫疫苗包括灭活全菌体死疫苗、减毒活疫苗。虽然灭活全菌体死疫苗在预防腺型鼠疫有一定效果,但对肺型鼠疫无效;减毒活疫苗又具有潜在的毒性。近年来,DNA 疫苗由于能够诱导出较好的体液免疫和细胞免疫而日益受到重视,被誉为疫苗的第三次革命。tPA 信号肽可以促进异种蛋白的分泌表达,增强表达抗原的免疫原性。本文对鼠疫耶尔森氏菌新型DNA 疫苗进行了初步研究,选取鼠疫菌保护性抗原F1、V 蛋白编码基因和人tPA 信号肽为研究对象,PCR 扩增鼠疫菌F1 和V 编码基因,分别与克隆载体pGEM-T 连接后测序,将测序正确的片段与真核表达质粒pVAX1连接,分别构建重组真核表达质粒pVAX1/F1、pVAX1/V 和pVAX1/F1-V,扩增tPA 信号肽,分别插入到F1、V 和F1-V 目的基因的上游,构建分泌型重组真核表达质粒tPA-pVAX1/F1、tPA-pVAX1/V 和tPA-pVAX1/F1-V。重组质粒转染COS-7 细胞,细胞免疫化学方法和Western blot 方法鉴定结果显示重组质粒可表达F1、V 和F1-V 蛋白。在此基础上,重组质粒分别加细胞因子佐剂GM-CSF 免疫BALB/c 小鼠,每组10只,并设PBS 组为阴性对照,100μg/只,双侧股四头肌肌肉注射,隔周免疫一次,加强免疫3 次,检测细胞免疫和体液免疫指标,ELISA 方法检测小鼠血清中总IgG 水平,免疫组显著高于PBS 对照组（P<0.01）,在初次免疫后tPA-pVAX1/V 和tPA-pVAX1/F1-V组可以诱导出较高的抗体水平,而其它组要至少二次免疫后才能达到相应水平。抗体亚型分类检测结果显示tPA-pVAX1/V 和tPA-pVAX1/F1-V 组的IgG2a 水平显著提高,说明分泌型tPA-V 和tPA-F1-V DNA疫苗免疫在机体内成功地增强了Th1型细胞免疫为主的免疫应答。ELISPOT 方法检测了特异性活化的可以分泌IFN-γ的CD8+ T 淋巴细胞数,免疫组小鼠形成斑点的细胞数均显著多于PBS 对照组（P<0.01）,以tPA-pVAX1/V 和

论文目录

• 英文缩写
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 鼠疫耶尔森氏菌新型候选 D N A 疫苗的构建及其免疫效果鉴定
• 前言
• 第一章 实验材料和方法
• 实验材料
• 实验方法
• 第二章 实验结果
• Yersinia pestis 候选 DNA 疫苗的构建与表达
• Yersinia pestis 候选 D N A 疫苗的构建
• Yersinia pestis 分泌型候选 D N A 疫苗的构建
• 免疫细胞化学方法鉴定重组质粒在 C O S -7 细胞中的表达
• Western blot 方法检测重组质粒在 C O S -7 细胞中的表达
• Yerinia pestis 候选 D N A 疫苗诱发的体液免疫应答
• Yerinia pestis 候选 D N A 疫苗诱发的细胞免疫应答
• Yersinia pestis 候选 DNA 疫苗保护效率的测定
• 第三章 讨论
• 全文小结
• 致谢
• 参考文献
• 附: 鼠疫耶尔森氏菌重组 V 蛋白在大肠杆菌中的高效表达纯化及鉴定
• 文献综述 D N A 疫苗的免疫机制及其优化策略
• 参考文献
• 研究生期间发表论文情况