论文摘要
随着人们生活水平的提高,心血管疾病已成为现今威胁人类生命健康的最主要杀手之一。心血管疾病最主要的死亡原因是冠心病。对于冠心病的治疗原则是尽快恢复血液灌注。但动物实验和临床研究发现,随着血运的恢复,某些受损的心肌细胞功能及结构破坏反而加重,即缺血再灌注损伤（Ischemia andreperfusion injury,I/R）。再灌注损伤是在心肌缺血后再灌注的过程中,因氧化应激反应产生大量氧自由基、超氧阴离子等,加速心肌细胞凋亡和坏死,使心肌梗死范围扩大、心功能恶化。临床表现为在闭塞的冠状动脉再通及梗死区血液灌流重建后一段时间内,有的患者发生血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等一系列病情恶化的现象。临床实践中如心肌梗死溶栓再通后、冠脉搭桥、心脏移植、心脏骤停心脏复苏后、体外循环心脏手术后等均存在再灌注损伤问题。如何做到既保证尽早恢复缺血组织的血流,又减轻甚至解除再灌注损伤的发生便成为缺血性心脏病防治中的重要课题。有效防治再灌注损伤的重要前提是阐明其发病机制。因此,关于I/R病理机制的研究越来越受到广大基础和临床工作者的重视。最近,一种新的与细胞凋亡有关的酶——多ADP核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,PARP]被提出。PARP是一个家族酶,包括:PARP-1、PARP-2、PARP-3、tankyrase-1、tankyrase-2、sPARP、vPARP。广泛存在于真核细胞核内,具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用。环境刺激、自由基、氧化剂和基因毒性介质所引起的DNA链的缺口或断裂均可引起PARP活化。PARP在体内的作用取决于DNA的损伤程度。少量的DNA损伤引起的PARP活化时,通过裂解底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生成ADP-核糖,引起包括PARP自身在内的多种蛋白酶发生多聚（ADP-核糖）基化,参与DNA链的修复。但大量DNA损伤时PARP过度活化,利用NAD+形成大量的（ADP-核糖）聚合物,机体在重新生成NAD+时将消耗ATP,能量耗竭将最终导致细胞死亡。在大多数疾病过程如炎症、循环休克和I/R中产生大量的自由基和氧化剂导致大量DNA损伤,PARP被持续过度激活,NAD+被大量消耗,从而影响糖酵解、三羧酸循环和线粒体的电子传递,ATP耗竭,细胞因DNA的修复不敌能量的消耗而死亡。这样导致疾病的恶化,而疾病恶化又会进一步激活PARP,形成恶性循环。研究表明PARP的过度激活在心肌I/R损伤、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的发展过程中起重要的作用。尽管目前的研究表明PARP在心脏I/R损伤中发挥重要的作用,但是其中的机制却远未清楚。例如PARP调控哪些细胞因子,通过哪些信号途径发挥作用,这些问题构成了本研究课题的内容。在本研究中,我们拟以大鼠为研究对象,建立心脏I/R模型,检测心肌中PARP的表达,PARP对心肌细胞凋亡、心肌梗死面积的影响,并探讨PARP对心肌中炎症因子的调节,对细胞凋亡有关信号通路的调节。通过以上研究,进一步明确PARP在心脏I/R损伤中所起的作用及其机制。这对于阐明冠心病的发病机制,为冠心病提供新的治疗途径具有重要的意义。本研究共分三部分进行。第一部分多ADP-核糖聚合酶在大鼠心脏I/R损伤中的作用目的本部分研究拟建立大鼠心脏I/R模型,应用药物3,4-dihydro-5-[4-（1-piperidinyl）butoxy]-1（2H）-isoquinolinone（DPQ）抑制PARP在心肌中的表达,测定心肌细胞的凋亡、心肌梗死面积,明确PARP在大鼠心脏I/R损伤中的作用。方法1.大鼠心脏I/R损伤模型的建立和分组:采用开胸结扎和松开冠状动脉的方法建立大鼠心脏I/R损伤模型。分为以下四组:对照组、I/R组、I/R+DPQ组和I/R+DMSO（二甲基亚砜）组。2.心肌细胞凋亡的检测:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术（TUNEL）试剂盒检测各组大鼠心肌细胞的凋亡。按照试剂盒说明书操作。标记前用DNA酶处理切片做阳性对照,用标记液代替TdT酶反应液做阴性对照。每张切片随机选取10个视野（×400倍）,计数凋亡细胞个数和所有细胞个数,以凋亡细胞个数/所有细胞个数反映各组心肌细胞凋亡的情况。3.心肌梗死面积检测:采用硝基四氮唑蓝（NBT）染色检测各组大鼠心肌梗死面积。染成蓝色部分为存活心肌,非染色部分为梗死心肌。用多媒体彩色病理图像分析系统测量每个切片的面积、心肌梗死面积,计算心室肌总面积和心室肌梗死总面积,算出梗塞心肌面积占心室面积百分比。4.应用电镜和HE染色检测各组大鼠心肌的损伤。结果1.PARP在大鼠I/R心肌中大量表达,应用DPQ后,PARP表达降低:对照组大鼠心肌中只有微弱的PAR表达。I/R组大鼠心肌中的PAR表达明显增加。应用DPQ以后,PAR表达降低,与I/R组相比P＜0.05。说明DPQ有效抑制了PARP在I/R大鼠心肌中的表达。2.抑制PARP可减少大鼠心肌梗死面积:I/R和I/R+DMSO两组大鼠的心肌梗死面积分别占整个左心室面积的43.48±3.89%和41.15±5.26%,两者相比无显著性差异。I/R+DPQ组大鼠的心肌梗死面积/左心室面积减少至25.47±5.88%,与I/R组及I/R+DMSO组大鼠相比P＜0.05。说明在I/R大鼠中抑制PARP的表达能显著减少心肌梗死面积。3.抑制PARP减少大鼠心肌细胞凋亡率:在对照组大鼠心肌中无TUNEL染色阳性细胞。在I/R组和I/R+DMSO组大鼠心肌中,TUNEL染色阳性细胞分别占全部细胞的35±5.3%和37±2.1%,说明I/R可引起心肌细胞凋亡增加,两者相比无显著性差异。在I/R+DPQ组大鼠心肌中,TUNEL染色阳性细胞占全部细胞的20±4.1%,与I/R及I/R+DMSO组大鼠相比P＜0.05。说明在I/R大鼠中抑制PARP的表达能减少心肌细胞凋亡率。结论1.在大鼠心肌I/R损伤中PARP明显激活,激活的PARP能加重心脏的损伤。2.抑制PARP在大鼠心脏I/R中的激活能减少心肌梗死面积和心肌细胞的凋亡率,减轻心肌细胞的损伤程度,具有心脏保护作用。第二部分PARP对核因子-κB活性及炎症因子的调节目的探讨在大鼠心脏I/R中PARP对心肌组织中核因子-κB（NF-κB）活性及炎症因子的调节。方法1.大鼠心脏I/R损伤模型的建立和分组:采用开胸结扎和松开冠状动脉的方法建立大鼠心脏I/R损伤模型。分为以下四组:对照组、I/R组、I/R+DPQ组和I/R+DMSO组。2.采用电泳迁移率变动分析（EMSA）检测各组大鼠核因子-κB（NF-κB）的活性。3.采用逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot方法检测各组大鼠心肌组织中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）,环氧化酶-2（COX-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA和蛋白的表达。结果1.抑制PARP可显著减少大鼠I/R心脏NF-κB的活性:对照组大鼠心肌中只有微弱的NF-κB激活。在I/R组和I/R+DMSO组大鼠心肌中NF-κB活性明显增加。应用DPQ抑制PARP后,NF-κB活性降低。两者相比P＜0.05。2.抑制PARP减少大鼠I/R心脏中炎症因子的表达:对照组大鼠心肌中只有微弱的ICAM-1,COX-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达。在I/R组和I/R+DMSO组大鼠心肌中的ICAM-1,COX-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达明显增加,两者相比无显著性差异。应用DPQ以后,ICAM-1,COX-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达降低。与I/R组及I/R+DMSO组大鼠相比P＜0.05。结果1和2表明抑制PARP能降低I/R大鼠心肌中NF-κB的活性以及炎症因子的表达。结论1.在大鼠心脏I/R损伤中NF-κB活性增强,ICAM-1、COX-2、MMP-9等炎症因子表达明显增加。2.在大鼠心脏I/R中PARP能够通过调节NF-κB的活性和ICAM-1、COX-2、MMP-9等炎症因子表达导致心脏损伤。3.抑制PARP能降低I/R大鼠心肌中NF-κB的活性以及ICAM-1、COX-2、MMP-9等炎症因子表达,减轻心脏损伤。第三部分PARP对凋亡诱导因子（AIF）和Akt信号通路的调节目的探讨在大鼠心脏I/R中PARP对AIF的调节,PARP对Akt及其下游分子糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）和叉头蛋白（FOXO3a）的调节。（PARP/JNK/AIF和PARP/Akt信号通路在大鼠心脏I/R损伤中的作用）方法1.大鼠心脏I/R损伤模型的建立和分组:采用开胸结扎和松开冠状动脉的方法建立大鼠心脏I/R损伤模型。分为以下六组:对照组、I/R组、I/R+DPQ组、I/R+DMSO组、I/R+DPQ+LY294002（Akt抑制剂）组和I/R+SP600125（JNK抑制剂）组。2.采用Western Blot检测各组大鼠心肌中PARP、JNK、AIF、Akt、GSK-3β和FOXO3a的表达结果1.抑制PARP减少JNK的表达:在I/R组大鼠心肌中磷酸化JNK表达增多,应用DPQ后磷酸化JNK的表达下降,说明磷酸化JNK的表达与PARP有关,JNK是PARP的下游分子。2.抑制PARP减少AIF从心肌细胞核到线粒体的转移:在I/R组大鼠心肌细胞核中AIF的表达增多,抑制PARP后其表达减少;另一方面,在I/R组大鼠心肌细胞线粒体中AIF的表达减少,而抑制PARP后其表达增多。说明抑制PARP可以减少AIF从线粒体向细胞核的转移,证实AIF是PARP的下游分子。3.抑制JNK减少AIF的从心肌细胞核到线粒体的转移:在I/R组大鼠心肌细胞核中AIF的表达增多,抑制JNK后其表达减少;另一方面,在I/R组大鼠心肌细胞线粒体中AIF的表达减少,而抑制JNK后其表达增多。说明抑制JNK可以减少AIF从线粒体向细胞核的转移,证实AIF是JNK的下游分子。结果1、2和3证实,在大鼠I/R损伤模型中,PARP调节AIF从线粒体向细胞核的转移,在这个过程中,JNK起了重要的作用。PARP通过JNK来发挥调节AIF的作用。PARP/JNK/AIF信号通路是介导大鼠心脏I/R损伤的一条重要的通路。4.抑制PARP增加磷酸化Akt、磷酸化GSK-3β和磷酸化FOXO3a的表达:在I/R组大鼠心肌中磷酸化Akt、磷酸化GSK-3β和磷酸化FOXO3a表达均增多。应用DPQ抑制PARP后,上述因子的表达进一步增多。5.抑制Akt减少磷酸化GSK-3β和磷酸化FOXO3a的表达:在抑制PARP的基础上进一步抑制Akt,磷酸化GSK-3β和磷酸化FOXO3a的表达降低。但仍然高于I/R组大鼠。而总Akt、总GSK-3B和总FOXO3a在各组大鼠中保持不变。结果4和5证实,在大鼠心脏I/R组损伤中,PARP通过PARP/Akt/GSK-3β和PARP/Akt/FOXO3a信号通路发挥作用。结论1.在大鼠心脏I/R损伤模型中,PARP调节AIF从线粒体向细胞核的转移,在这个过程中,JNK起了重要的作用。PARP通过JNK来发挥调节AIF的作用。PARP/JNK/AIF信号通路是介导大鼠心脏I/R损伤的一条重要的通路。2.在大鼠心脏I/R组损伤中,PARP通过调节Akt介导的细胞存活信号通路而发挥作用。