松江鲈（Trachidermus fasciatus）热应激蛋白及相关蛋白的cDNA克隆与原核表达

论文摘要

松江鲈（Trachidermus fasciatus Heckel）隶属于鲉形目（Scorpaeniformes）,杜父鱼科（Cottidae）,松江鲈属（Trachidermus）,为国家二级保护动物,中国四大名鱼之一。历史上松江鲈分布区较广,是我国渤海、黄海、东海沿岸及相邻淡水水域的习见鱼类。现在由于水利建设的发展,环境污染的影响以及人为捕捞因素,松江鲈赖以生存和繁衍的生态环境遭到严重的破坏。目前,松江鲈在我国许多水域已绝迹,亟待拯救。对此,我国首家松江鲈自然保护区已在山东省文登市埠口正式成立。原地保护外,对松江鲈进行人工驯养与繁殖也极其重要。因此,开展对松江鲈环境适应性、抗病性、病原及环境胁迫下的免疫学研究,将具有重要的理论和实际应用价值。目前,热应激蛋白以其独特的生物学特性和功能在生命科学领域受到较多关注。同时,热应激蛋白的诱导合成与海洋生物的抗病、耐盐和耐热性的获得以及各种环境胁迫下（高渗透压等）热应激蛋白的变化等也成为海洋生物学研究的大热点。鉴于热应激蛋白在生物体免疫、抗病、环境适应等方面的重要性,本文选取三种热应激蛋白（HSC70、GRP94、HS6B）及一种相关蛋白（HSBP1）对松江鲈进行免疫相关的基础研究。本文采用RACE-SMART技术克隆得到了四种蛋白的cDNA全长,并成功构建了其原核表达载体,获得了重组表达蛋白。主要结果如下：获得HSBP1cDNA序列全长1821bp,其中开放阅读框234bp,编码78个氨基酸。氨基酸同源比对表明,松江鲈与其他已知部分鱼类的同源性为82.28%-98.70%,与两栖类、鸟类以及哺乳类的同源性为75.32%-79.22%。成功构建了HSBP1的pET-30a（+）重组质粒,并转化Rosseta表达菌株,在37℃下,IPTG诱导4h后获得比预期稍大的20KD左右重组蛋白,重组蛋白为可溶蛋白。由High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱进一步纯化。得到HSC70的cDNA序列全长2138bp,开放阅读框1947bp,编码629个氨基酸。序列中发现了HSP70家族的三个标签序列,且C-末端具有细胞质HSP70的基序（EEVD）。氨基酸同源比对显示HSC70在各物种间的同源性非常高,保守性非常好。其中,松江鲈与其他已知部分鱼类的同源性为88.89%-97.09%,与两栖类,爬行类、鸟类以及哺乳类的同源性为85.36%-93.98%。成功构建了HSC70的pET-30a（+）重组质粒,并转化BL21 （DE3）表达菌株,在37℃下,IPTG诱导4h后,获得高表达量的76.4KD目的蛋白。经检测目的蛋白以包涵体形式存在。而25℃过夜诱导后部分目的蛋白为可溶蛋白。重组表达的粗蛋白经High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱得到进一步纯化。获得GRP94的cDNA序列全长2736bp,开放阅读框2418bp,编码806个氨基酸。序列分析发现HSP90家族标签序列的5个氨基酸保守区域,C-末端内质网滞留信号KDEL,在松江鲈中都存在氨基酸变异。前22个氨基酸为信号肽；成熟蛋白包含一个HATPasec结构域。同源性比对发现,松江鲈与已知其他部分鱼类的同源性在83.58%-89.95%之间,与两栖类、鸟类和哺乳类的同源性在77.87%-81.09%之间,氨基酸序列在各物种间较保守。进化分析显示鱼类的GRP94在系统发育树上单独成一支。GRP94的原核表达载体（pET-30a（+））被成功构建,在37℃下,IPTG诱导4h后,在BL21（DE3）表达菌株中有较低表达量的98.2KD目的蛋白被表达。改变诱导温度、时间以及IPTG浓度后,其目的蛋白的表达量均未得到提高。获得HS6B的cDNA序列全长1127bp,开放阅读框为522bp,编码174个氨基酸。成熟蛋白包括一个独立的RHOD结构域。氨基酸同源性比对结果显示,HS6B比其他热应激蛋白在各物种间的同源性要低、保守性要差。构建了HS6B的RHOD结构域pET-30a（+）重组质粒,转化BL21 （DE3）表达菌株,在37。C,IPTG诱导4h下目的蛋白表达量较低：而在25℃下过夜诱导,获得高表达量的18.4KD目的蛋白。超声破碎后,经SDS-PAGE电泳检测发现,37℃诱导4h后表达的蛋白为不可溶的包涵体；而25℃过夜诱导后表达的目的蛋白大部分为可溶性蛋白。粗蛋白经High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱纯化得到纯化蛋白。本研究可为高效的松江鲈人工驯养及繁殖提供科学理论依据,为鱼类的疾病防治提供新的思路,也为鱼类热应激蛋白的研究提供基础资料。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 热应激蛋白研究进展
• 1.1.1 HSPs的发现
• 1.1.2 HSPs的生物学特性及功能
• 1.1.3 HSPs的分类、分布及结构
• 1.1.4 HSPs的表达与调控
• 1.1.5 HSPs在鱼类中的研究进展
• 1.2 松江鲈研究简介
• 1.3 本研究的目的与意义
• 第二章 松江鲈HSBP1基因的克隆与原核表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 测序结果及序列分析
• 2.2.2 同源比对与进化树构建
• 2.2.3 原核表达载体的构建
• 2.2.4 重组菌的表达
• 2.2.5 表达蛋白的可溶性分析
• 2.2.6 蛋白纯化
• 2.3 讨论
• 2.3.1 结构、同源比对与进化
• 2.3.2 表达产物与预期大小不一致
• 2.3.3 蛋白纯化
• 2.4 小结
• 第三章 松江鲈HSC70基因的克隆与原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 测序结果及序列分析
• 3.2.2 HSC70同源比对与进化树构建
• 3.2.3 原核表达载体的构建
• 3.2.4 重组表达
• 3.2.5 表达蛋白的可溶性分析
• 3.2.6 蛋白纯化
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 松江鲈GRP94基因的克隆与原核表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 测序结果及序列分析
• 4.2.2 同源比对与进化树构建
• 4.2.3 原核表达载体的构建
• 4.2.4 重组表达
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 松江鲈HS6B基因克隆与原核表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 测序结果及序列分析
• 5.2.2 同源比对与进化树构建
• 5.2.3 原核表达载体的构建
• 5.2.4 重组表达
• 5.2.5 表达蛋白的可溶性分析
• 5.2.6 蛋白纯化
• 5.3 讨论
• 5.3.1 HS6B同源比对、结构域
• 5.3.2 诱导时间和温度对表达产物的影响
• 5.4 小结
• 第六章 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表