真核表达质粒PIRES-Ag85B的构建及其在CHO细胞中的表达

论文摘要

目的：构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,通过酶切鉴定和测序鉴定后在CHO细胞中进行表达,并用Western-blot检测表达结果,为开发新型的结核病疫苗和结核病血清免疫诊断试剂奠定基础。方法：根据GenBank上结核分枝杆菌Ag85B基因的CDS序列,应用primer premier5.0设计一对引物,分别在引物5’端引入Nhe I和EcoR I酶切位点及保护碱基。从结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取基因组DNA,应用引物,扩增Ag85B基因片段,用PCR回收试剂盒割胶回收后纯化PCR产物,双酶切PCR产物及真核表达质粒PIRES,经T4DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,用氨苄青霉素筛选阳性克隆后,再经PCR,双酶切和测序进行鉴定。应用脂质体转染技术,将重组质粒PIRES-Ag85B转染CHO细胞,48小时后用G418进行筛选,并用Western blot检测Ag85B的基因表达。结果：从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增出978bp的Ag85B基因,并成功构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳获得61,000bp和978bp的条带,与预期结果一致,经测序证实获得目的基因序列与GenBank公布的一致,转染CHO细胞后获得稳定表达Ag85B的CHO细胞株,用Western blot方法在蛋白水平检测Ag85B的基因表达。结论：1从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因片段并成功构建真核表达质粒PIRES-Ag85B。2 Ag85B目基因在CHO细胞中获得表达。图：14表：1参：49

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图
• 注释说明清单
• 引言
• 1 结核防治性疫苗的研究进展
• 1.1 MTB感染的致病与免疫机制
• 1.1.1 MTB感染的致病机制
• 1.1.2 MTB感染的免疫机制
• 1.2 抗结核菌疫苗
• 1.2.1 亚单位疫苗（Subunit vaccine）
• 1.2.2 重组BCG（rBCG）
• 1.2.3 DNA疫苗（DNA vaccine）
• 1.2.4 转基因植物疫苗（Transgenic plant vaccine）
• 1.2.5 减毒活疫苗（Live attenuated vaccine）
• 1.2.6 序贯免疫策略（Prime-boost regimen）
• 1.3 结语
• 2 真核表达质粒PIRES-Ag 85B的构建及其在CHO细胞中的表达
• 2.1 结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果
• 2.2 聚合酶链式反应扩增Ag85B基因
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 方法
• 2.2.4 结果
• 2.3 真核表达质粒PIRES-Ag85B的构建及鉴定
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 分析软件及网址
• 2.3.3 方法
• 2.3.4 结果
• 2.4 PIRES-Ag85B重组体在CHO细胞中的表达
• 2.4.1 材料
• 2.4.2 方法
• 2.4.3 结果
• 2.5 讨论
• 结讨
• 参考文献
• 附录 结核分枝杆菌Ag85B全基因编码序列
• 致谢
• 作者简介及读研期间主要科研成果