猪的诱导性多潜能干细胞向视网膜感光细胞分化的体内及体外研究

论文摘要

目的：探讨猪的诱导性多潜能干细胞（piPSC）在体外分化成视网膜神经细胞的方法。研究piPSC移植治疗猪的视网膜损伤的效果。材料与方法：piPSC在放射处理后的SNL细胞上培养并传代。取第28代、第40代和第43代piPSC分别悬浮培养3天后形成胚胎体,再将胚胎体转至未稀释基质胶,1：10和1：20稀释的基质胶以及层粘连蛋白-纤维连接蛋白基质上粘附培养以使其分化。用免疫荧光染色和实时PCR技术检测piPSC以及分化细胞中干细胞标志物OCT4、ABCG2、Nanog、Sox2,神经细胞标志物TUBB3,感光细胞标志物RCVRN、NRL、RHO、IRBP、ROM1和ARR3以及视杆细胞型双极细胞标志物PRKCA的表达,计数表达上述标志物的细胞的比例以及在形态上具有外节结构细胞的比例。用带IRBP-GFP基因的慢病毒感染分化后的细胞,使视锥型和视杆型感光细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。碘乙酸（IAA）静脉注射建立猪视杆细胞损伤的动物模型,将感染GFP的piPSC分化细胞移植入的一侧病眼视网膜下,对侧病眼视网膜下注射DMEM/F12培养液作为对照。分别在用药前及细胞移植术后三周检测视网膜电生理反应（ERG）。术后3周摘取视网膜,切片,通过免疫荧光染色观察移植后的细胞在病变视网膜中的整合情况。结果：实时PCR和免疫荧光染色显示分化后的细胞失去干细胞特异性基因OCT4、Nanog和Sox2的表达,转而表达视网膜感光细胞基因RCVRN、NRL、RHO、IRBP、ROM1和cone-arrestin。其中有30.91±7.2%的分化细胞表达转录因子NRL,25.61±8.5%表达RCVRN,6.765±2.083%表达RHO,此外还有2.6±0.4%的细胞表达PRKCA。以层粘连蛋白—纤维连接蛋白为细胞外基质可以分化出更多的RHO阳性细胞,但其外形更类似普通神经细胞。以基质胶为细胞外基质可以分化出更多的具有视杆细胞形态的细胞,即有外节结构的细胞。用携带IRBP-GFP基因的病毒感染分化细胞后,约44%的细胞表达GFP。这些细胞已经定向分化成视网膜感光细胞前体细胞或成熟细胞。移植到视网膜下后可检测到RHO阳性的细胞在视网膜各层均有表达,其主要表达部位在视网膜外核层,即正常的感光细胞所在的位置。在这些整合入视网膜的移植细胞中,有一部分细胞具有外节结构。结论：piPSC能在体外高效地分化成视网膜神经细胞并且部分细胞具有与原代培养的视杆细胞类似的外节样结构。将这些分化的细胞移植入视杆细胞损伤的猪视网膜下方,移植细胞可以整合入受损视网膜。部分移植细胞在眼内分化出外节结构,这可能有助于视觉功能的恢复。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 1. 主要试剂和仪器
• 1.1 主要的实验试剂
• 1.2. 主要实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 piPSC的细胞培养方法
• 2.2 piPSC的分化方法
• 2.3 视网膜细胞原代培养
• 2.4 免疫荧光染色
• 2.5 实时聚合酶链式反应（Real time-polymerase chain reaction,RT—PCR）
• 2.6 用绿色荧光蛋白标记分化的piPSC细胞
• 2.7 建立piPSC移植治疗猪视网膜病变的动物模型
• 2.8 获取piPSC移植后的视网膜组织标本并检测移植细胞整合情况
• 2.9 ERG检测视网膜功能
• 3. 统计分析
• 结果
• 1. piPSC形态学特征、生长特点以及表达干细胞分子标志物的情况
• 2. 视黄酸和牛磺酸对piPSC向视网膜细胞方向分化无促进作用
• 3. piPSC分化为视网膜感光细胞
• 4. piPSC能分化成视杆细胞前体细胞以及视杆细胞型双极细胞
• 5. 基质胶是piPSC向视杆细胞定向分化的必要条件
• 6. 静脉注射碘乙酸引起猪的视网膜视杆细胞损伤和缺失
• 7. piPSC分化细胞表达IRBP—GFP
• 8. RHO阳性细胞整合进入受体猪的外核层
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果