论文摘要
再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是血液系统常见的疾病，是多种原因引起的造血功能障碍，其发病原因极为复杂，发病机制至今未完全清楚。在再障患者骨髓中，各种类型的造血干／祖细胞均明显减少或缺如；患者造血衰竭的程度与骨髓中造血细胞的数量成正比；并且在再障患者骨髓涂片中，造血细胞比率明显减少、非造血细胞比率明显增多及在骨髓单个核细胞培养中，无论红系、还是粒系集落数明显减少，均提示造血干细胞缺乏导致造血功能衰竭可能是再障发病的主要因素。干细胞因子（SCF）及其受体C-KIT，广泛的分布于各种发育阶段的造血细胞及其他一些组织中，调控着干细胞的分化及成熟。自SCF及其受体C-KIT发现以来，人们就想到二者同再生障碍性贫血是否存在着联系。近年来研究表明C-KIT基因的异常涉及许多疾病的发生，尤其在一些血液疾病和恶性肿瘤中，出现了基因的表达异常和结构的突变，较高的突变位点集中在外显子9、11、13，并且在一些肿瘤细胞中，表现了不止一个部位的基因变异。由此提示我们在儿童再障的发病中，是否也存在着C-KIT的表达和结构异常?目的：通过研究再生障碍型贫血儿童中造血干细胞因子受体C-KITmRNA的表达和C-KIT基因Exon 9、11、13结构是否存在着突变，以探讨其在儿童再生障碍性贫血发病中的作用。材料与方法：采集2005年07月至2006年02月期间，郑州大学第三附属医院、郑州大学第一附属医院儿内科经骨髓确诊的再生障碍性贫血患儿抗凝骨髓共15例为实验组，其中男6例，女9例，年龄2.5～13岁，中位年龄6岁；正常儿童骨髓15例为对照组，男7例，女8例，年龄2～13岁，中位年龄6.5岁，为随机选择的在郑州大学第三附属医院排除恶性血液疾病的儿童，二者年龄、性别构成没有差异。结合C-KIT基因的结构特点，我们选择了有代表性的三个位点，即编码细胞外膜结构域的C-KIT外显子9基因、编码并膜结构域的C-KIT外显子11基因、编码细胞内结构域的C-KIT外显子13基因为检测对象。根据美国国立医学图书馆（National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸序列数据库中C-KIT基因序列，应用Primer 5.0软件设计出引物序列。对实验组和对照组骨髓标本分别采用骨髓单个核细胞提取术提取单个核细胞后、应用RNA提取试剂提取单个核细胞的总RNA，然后逆转录成cDNA；并通过特异引物用PCR方法扩增C-KII基因外显子9、11、13；用琼脂糖凝胶电泳和凝胶图象系统对进行产物分析，比较正常儿童骨髓与再障儿童C-KIT外显子9、11、13产物有无表达的差异；对C-KIT外显子9、11、13阳性表达的正常儿童和再障标本，再次进行SSCP（单链多态构象分析）以期发现有无结构的改变；对C-KIT基因外显子9、11、13 PCR产物提纯后进行序列分析测定，比较再障患儿与正常儿童C-KIT的有无突变位点。结果：①经琼脂糖凝胶电泳和凝胶图象系统分析后，发现再障患儿与正常儿童C-KIT基因Exon 9、11、13 mRNA的表达二者间没有统计学意义（P＞0.05）；②经过单链多态构象分析发现，再障患儿C-KIT基因Exon 9、11、13的碱基序列与正常对照儿童相比无差异；③基因序列测定与Genebank中的基因图谱进行比对，Exon 9、11、13均未见碱基序列改变或碱基数目的增多、缺失等情况存在，说明了该基因结构没有改变。结论：琼脂糖凝胶电泳和凝胶图象系统发现再障患儿与正常儿童C-KIT基因Exon 9、11、13 mRNA的表达没有差异；单链多态构象分析未发现再障患儿C-KIT基因Exon 9、11、13的碱基序列异常；基因序列测定未见再障患儿C-KIT基因Exon 9、11、13碱基序列改变；这些说明①C-KIT受体在再障儿童的骨髓造血细胞中的数量分布正常，并且其mRNA表达水平不降低；②C-KIT受体在再障儿童基因结构没有改变，未见碱基序列改变或碱基数目的增多、缺失等情况；③再障儿童SCF／C-KIT信号系统的异常中，C-KIT起了非关键的作用；SCF在其中可能起到主要的作用；④再障患儿SCFmRNA表达下降而C-KITmRNA表达及基因结构正常，为SCF在再障的治疗中提供了实验依据，但SCF基因结构尚需进一步研究。
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标签：再生障碍性贫血论文; 造血干细胞因子受体论文; 基因论文; 儿童论文;