Smac通路在内毒素促肝细胞凋亡中的作用及机制探讨

论文摘要

【背景与目的】近年研究表明，细胞凋亡是导致肝脏损伤的一个重要细胞机制之一，内毒素血症作为肝衰竭的第二次打击，在肝衰竭发生发展过程中发挥重要作用。线粒体释放的第二种Caspase激活物smac是2000年发现的一种促凋亡分子。它正常时位于线粒体膜间间隙，在凋亡诱导因子的作用下，可释放入胞浆，与凋亡抑制蛋白IAPs结合并解除其对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的抑制作用，从而使Caspase9和Caspase3活性增强，促进细胞凋亡发生。本实验采用D-氨基半乳糖氨建立大鼠肝衰竭模型和体外LPS刺激L02肝细胞，探讨促凋亡蛋白smac从线粒体释放及对Caspase9和Caspase3的活性的影响，为肝衰竭内毒素血症防治措施提供新的思路。【实验材料和方法】一．细胞培养L02传代肝细胞株由我校肝病研究所提供，肝细胞培养在含有10％小牛血清高糖的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每隔3-4天对细胞进行传代，分别培养在六孔板中，100ug／ml LPS分别刺激4 h、8 h、16 h、24 h，收集各组的肝细胞进行检测。二．动物模型采用D-GaLN诱导急性肝衰竭大鼠模型，24只wistar健康大鼠随机分为四组，组Ⅰ：空白对照组（生理盐水组），组Ⅱ：100mg／kg D-GaLN模型组，组Ⅲ：200mg／kg D-GaLN模型组，组Ⅳ：300mg／kg D-GaLN模型组。三．标本采集和处理于腹腔注射D-GaLN后24小时，采用6％的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下分离出股静脉，切除股静脉并用肝素抗凝管取全血，低温离心取血清，并取肝脏组织，置于液氮中速冻，分别于—70℃保存待测。四．实验方法1．Hoechst和吖啶橙染色荧光显微镜观察L02细胞凋亡。2．流式分析仪检测L02细胞凋亡。3．流式分析仪检测Smac在L02肝细胞膜的表达。4．采用免疫组化方法检测Smac和Caspase9的L02肝细胞的表达。5．caspase3活性检测试剂盒检测L02肝细胞Caspase3活性。6．L02肝细胞线粒体与胞浆分离。7．Western blotting分析L02肝细胞线粒体上smac和细胞中Caspase9的表达。8．采用全自动生化分析系统检测大鼠血清谷丙转氨酶，总胆红素和总蛋白的水平。9．采用HE染色检测大鼠肝组织的病理变化。10．免疫组化方法检测Smac在大鼠肝组织的表达。11．采用鲎试剂基质显色法检测大鼠的血清内毒素水平。12．大鼠肝组织线粒体与胞浆分离。13．caspase3活性检测试剂盒检测大鼠肝组织Caspase3活性。14．Western blotting分析大鼠肝组织线粒体smac和细胞中Caspase9的表达。五．统计学分析方法所有资料采用SPSS13.0软件进行分析，实验数据均数以均数±标准差（x±s）表示，多组间采用方差分析，两组间采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。【结果】1．荧光显微镜下检测，Hoechst和吖啶橙染色显示L02凋亡细胞细胞核呈致密均匀蓝颜色和绿色荧光。2．正常对照组凋亡率0.30±0.10％，LPS刺激4 h、8 h、16 h、24 h后凋亡率分别2.30±0.45％、4.00±0.89％、6.20±1.17％、18.20±2.26％，呈进行性增高（P＜0.01），24 h期间达到一个凋亡高峰，与正常对照组比较差异有显著意义（P＜0.05）。3．正常对照组Smac表达为0.77±0.14％，LPS刺激4 h、8 h、16 h、24h后Smac在肝细胞膜的表达1.73±0.78％、2.84±0.56％、3.72±1.26％、8.66±1.93％，呈进行性增高（P＜0.05），呈现出时间依赖性。4．通过免疫组织化学的方法分别观察Smac和Caspase9在L02肝细胞的表达情况，免疫组化检测smac和Caspase9结果：smac蛋白和Caspase9蛋白表达阳性，主要定位在胞浆中，呈棕黄色颗粒。Smac和Caspase9蛋白随着LPS刺激时间的增长表达率呈现逐渐增高的趋势（P＜0.01），与正常对照组相比，各刺激组Smac和Caspase9蛋白表达显著增高（P＜0.05）。5．在给予LPS刺激4个小时水平变化不是很明显，只有轻度的升高。而在8h、16h、24h刺激组Caspase3活性显著增高，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。6．Western blot检测方法结果表明经过LPS处理4 h、8 h、16 h、24 h后细胞线粒体中Smac的表达量是逐渐降低的，与对照组比较差异具有显著的意义（P＜0.05）。相反，在细胞中caspase9表达量却逐渐升高，与对照组比较也有显著意义（P＜0.05）。7．肝衰竭模型肝组织HE染色未见正常的肝小叶，肝细胞混浊肿胀，并见散在大片坏死，汇管区炎症严重，可见汇管区周围出现大块坏死带。正常组肝组织结构正常。8．通过免疫组织化学的方法观察smac在肝组织中的表达情况，可见smac蛋白在胞浆中呈溶解状棕黄色表达。模型组相对于对照组明显升高。9．组Ⅱ血清ALT水平仅轻度增高，组Ⅲ和组Ⅳ显著增高，其中组Ⅳ高于组Ⅲ。且血清总胆红素随着D-GaLN的剂量的增大而升高，其中组Ⅳ明显升高（P＜0.05），但各组血清总蛋白正常，比较无差异（P＞0.05）。10．组Ⅰ大鼠体内未形成内毒素血症，组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ大鼠检测出明显的内毒素血症，且随着D-GaLN的剂量的增大内毒素血症的水平逐渐增高。与组Ⅰ比较具有统计学意义（P＜0.01）。11．caspase3活性在组Ⅱ轻度升高，与组Ⅰ比较具有统计学意义（P＜0.05）。组Ⅲ、组Ⅳ水平明显升高，且随着D-GaLN的剂量的增大caspase3活性逐渐增高，与组Ⅰ比较具有统计学意义（P＜0.01）（见表3）。12．Western blot检测方法结果表明经过D-GaLN诱导急性肝衰竭大鼠模型后，随着D-GaLN剂量的增加，细胞线粒体中Smac的表达量是逐渐降低的，与对照组比较差异具有显著的意义（P＜0.05）。相反，在细胞中caspase9表达量却逐渐升高，与对照组比较也有显著意义（P＜0.05）。【结论】本研究发现促凋亡蛋白smac在肝细胞存在高表达现象，体外实验中证明，内毒素可以直接促进人肝细胞的凋亡，其促进凋亡的通路可能包括了smac通路。并且内毒素可能可以促进smac从线粒体释放到细胞膜参与凋亡，而不仅是释放到胞浆。在肝衰竭模型实验中，单用D-GalN建立大鼠肝衰竭模型，证明D-GalN可以引发大鼠肝衰竭，出现明显的内毒素血症，随着内毒素水平的升高，可以促进smac从线粒体释放出胞浆进一步激活下游启动酶caspase9和效应酶caspase3，更加证明内毒素引发凋亡可能与smac通路有关。总之，线粒体信号通路在内毒素所致的肝细胞凋亡中发挥重要作用，其机制可能是通过促进Smac从线粒体向胞浆和胞膜释放，并活化其下游通路caspase9和caspase3有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 研究背景
• 第一部分 内毒素在体外诱导人肝细胞凋亡中的作用
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验方法
• 结果
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 促凋亡蛋白smac及下游通路在内毒素对体外肝细胞凋亡中的作用
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验方法
• 结果
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 D-GaLN大鼠肝衰竭模型并发内毒素血症对smac凋亡通路的影响
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述 促凋亡蛋白Smac/DIABLO
• 附录1 （缩略词表）
• 附录2 （攻读学位期间发表论文目录）
• 致谢