混合饲养层培养的人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化

论文摘要

糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一组以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢疾病群。糖尿病的病因尚未完全阐明,主要认为与遗传因素和环境因素等有关,口服降糖药和外源性胰岛素替代治疗是临床治疗的主要方法,但却无法防止晚期糖尿病并发症的产生。近年来胰腺或胰岛细胞移植作为目前治疗Ⅰ型糖尿病和部分Ⅱ型糖尿病效果最理想的方法不断受到关注。人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）是一种具有分化发育成三个胚层组织细胞潜能的全能性的细胞。利用hESCs的多向分化能力,将其定向诱导为胰岛素分泌细胞（insulin producing cells, IPCs）为糖尿病的细胞移植治疗提供了新的方向。目前虽已有文献报道hESCs成功诱导分化为胰岛素分泌细胞,但诱导分化效率偏低,成为胰岛素分泌细胞相关研究的主要障碍,故本研究通过经由拟胚体方法和贴壁培养方法及添加不同浓度诱导因子诱导混合饲养层培养体系的人胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞进行对比,通过优化体外诱导条件,以期达到最佳的诱导分化效率。目的比较不同诱导分化方法对hESCs向胰岛素分泌细胞分化效率的影响。方法1.实验材料为郑州大学第一附属医院生殖中心自主建立的hESCs系：ZZU（郑州大学）-hESC（人胚胎干细胞）-1,并在混合饲养层上培养。2. hESCs诱导为限定性内胚层过程中,根据加入活化素A的浓度（为25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml）不同分为3组。3.hESCs诱导为胰岛素分泌细胞过程中,根据经拟胚体法和贴壁培养直接诱导法分为2组,诱导分化主要分为4个阶段。4.采用Sox-17免疫荧光法测定限定性内胚层的表达,RT-PCR法检测各个阶段特异表达基因,诱导分化末行双硫腙染色和胰岛素释放实验鉴定分化成熟的胰岛样细胞团。5.通过比较不同诱导方案的诱导效率,得出较好的诱导方案。结果1.随着诱导分化时间的延长,可见细胞形态的变化。2.Sox-17免疫荧光结果示,活化素A的浓度为50ng/ml组和100ng/ml组诱导分化效率无明显差异（P>0.05）,25ng/ml组诱导分化效率低于上述两组.（P<0.05）。3.根据诱导分化末双硫腙染色、RT-PCR鉴定和胰岛素释放试验的结果估算出：采用贴壁培养细胞直接进行诱导分化,可得到较多的胰岛素分泌细胞。结论1、50ng/ml的活化素A同样可获得较多的限定性内胚层细胞,为后续的研究提供细胞。2、采用贴壁培养hESCs直接进行4阶段诱导分化得到胰岛素分泌细胞的效率较高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略词表
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读学位期间发表文章及参加会议情况
• 致谢