水环境中肠道病原体的PCR检测方法与健康风险评价研究

论文摘要

水环境的病原性污染是当今世界上危害最严重的问题之一。研究水体病原性污染状况，分析病原体对人类健康造成的风险具有十分重要的意义。用传统的微生物指标评价病原体造成的健康风险具有多方面的不确定性，而近年来发展起来的PCR技术具有灵敏度高、特异性好等优点，已在医学及相关领域的病原体检测中体现出其优越性。但是目前PCR技术用于水环境病原体检测还处于尝试阶段，有效的方法体系尚未建立，以此为基础的病原体健康风险评价方法还是空白。为此，本论文在国家自然科学基金项目“水环境中肠道感染性病毒群的PCR综合鉴定和病原性污染风险评价”的支持下开展研究，建立了高效实用的肠道病原体PCR检测方法和病原性污染评价指标，在进行水环境长期监测的基础上研究了肠道病原体在地表水体中的分布和变化规律，基于肠道病原体PCR检测的结果对不同水体进行了健康风险评价。本论文根据我国水传播疾病和水体病原性污染的特点，选取肠道病毒作为典型的病毒性病原体，伤寒沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌和霍乱弧菌作为典型的肠道病原菌，分别建立了定性和定量的PCR检测方法。采用改进的微孔滤膜吸附-洗脱浓缩法进行水体样品中肠道病毒的浓缩，研究了滤膜的孔径、材质、洗脱剂的种类、洗脱方式、PEG的浓度对病毒回收率的影响，进行了病毒浓缩方法的优化。研究结果表明，0．22μm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜比硝酸纤维素和尼龙膜的实用效果更好；采用3％牛肉膏-0．05mol／L甘氨酸缓冲液作为洗脱剂，使用磁力搅拌方式进行膜洗脱的方法具有效果好，操作方便等优点；在洗脱液浓缩步骤中，当PEG的最终浓度为130g／L时，病毒的回收率最高；改进的微孔滤膜吸附-洗脱法的病毒回收效果优于滑石粉-硅藻土吸附层吸附-洗脱法、化学絮凝沉淀法和滑石粉-硅藻土絮凝沉淀法等方法，对于不同接种量(38～3800CCID50)的病毒回收率均可达到70％以上。根据肠道病毒RNA5′非编码区中保守序列的同源性设计了针对首轮PCR和巢式PCR的两对肠道病毒通用引物，经GenBank数据库BLAST比对分析，所设计的通用引物涵盖了脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒71型等多种肠道病毒。利用脊髓灰质炎病毒1～3型，柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株，建立了肠道病毒巢式RT-PCR检测方法。结果表明，AMV酶能够有效完成病毒RNA的逆转录，比M-MLV酶更具有适用性；镁离子浓度2mmol／L，退火温度55℃是最佳的首轮PCR反应条件；巢式PCR不仅具有良好的特异性，而且灵敏度高达0．038CCID50，适用于低病毒浓度的环境水样检测。在肠道病毒RT-PCR检测的基础上，建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法，利用pMD18-T载体构建了重组质粒作为标准品，确定了反应体系中镁离子的最佳浓度为4．0mmol／L，最佳退火温度为55℃，读板温度为85℃；检测灵敏度为4．62GEC，且特异性良好，与其他微生物没有交叉反应；动力学线性范围广，在4．62～4．62×109GEC的模板量范围内，模板量的对数值与CT值之间具有良好的线性关系（R2=0．997）；精密度高，检测样品CT值批内变异系数低于2％，批间变异系数低于5％。针对典型肠道病原菌，分别建立了伤寒沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌和霍乱弧菌的常规PCR检测和实时荧光定量PCR检测方法。利用标准菌株，建立了典型肠道病原菌的实时荧光定量PCR标准曲线，伤寒沙门菌、志贺菌和大肠埃希菌的检测灵敏度分别为0．366CFU、0．44CFU和4．56CFU；当模板量分别在0．366CFU～3．66×105CFU，0．44CFU～4．4×105CFU和4．56CFU～4．56×105CFU的范围内时，模板量的对数值与CT值之间具有良好的线性关系。运用本研究建立的PCR检测方法，对西安市典型地表水体（饮用水源水—黑河）、景观湖泊—兴庆湖和北湖、城市排污河—浐河)中的肠道病原体进行了长期监测，并以污水处理厂二级处理出水作为参比，研究了肠道病毒和典型肠道病原菌在水环境中的分布规律。长达1年的监测结果表明，肠道病毒在各地表水体和二级处理出水中均被检出，且检出浓度服从对数正态分布规律；黑河、兴庆湖、北湖、浐河和二级处理出水中肠道病毒的年平均浓度分别为47GEC／L、127GEC／L、120GEC／L、422GEC／L和746GEC/L；黑河的肠道病毒在春夏两季阳性率高，浓度也较高；兴庆湖和北湖的肠道病毒的高阳性率和高浓度发生在夏末秋初；浐河的肠道病毒的阳性率和浓度普遍偏高，且浓度变化幅度大；对参比的二级处理出水而言，9月初至12月中旬和4月下旬至5月末是肠道病毒的高浓度期。各水体中肠道病毒的核酸序列具有较强的相似性，表明病毒种类比较单一。在对伤寒沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌和霍乱弧菌进行定量PCR检测的同时，也运用传统的培养法进行了细菌总数、大肠菌群的粪大肠菌群的检测。结果表明，霍乱弧菌在各地表水体中均呈阴性；其他各类病菌的检出浓度均服从对数正态分布规律；黑河、兴庆湖和北湖的伤寒沙门菌PCR检测结果全部为阴性，而浐河和二级处理出水的伤寒沙门菌浓度较高，但没有明显的季节变化规律；志贺菌在各种水体中均存在，但夏季之前浓度很低，进入夏季后浓度迅速升高；各水体的大肠埃希菌浓度都呈现从冬季到夏季逐渐升高的趋势。肠道病毒、典型肠道病原菌与传统细菌学和理化指标之间关系的分析结果表明：肠道病毒与细菌指标之间无显著相关性，在细菌浓度较低的水体中仍可能检出肠道病毒，细菌学指标难以代替肠道病毒的检测；水中细菌总数、大肠菌群、粪大肠菌群与水温、浊度、COD之间呈显著正相关，与溶解氧呈显著负相关；伤寒沙门菌的突增通常发生在大肠菌群、粪大肠菌群浓度超过103CFU／100mL时；志贺菌与传统细菌学指标呈显著正相关，其阳性率和浓度随着大肠菌群和粪大肠菌群浓度增大而逐渐上升，在大肠菌群浓度较低的水体中仍有志贺菌出现。根据肠道病原体的PCR检测结果，结合暴露途径和剂量反应关系分析，运用数学模型对不同地表水体中肠道病原体造成的健康风险进行了评价。判定了各水体中的“最大风险肠道病原体”，并提出了相应的风险控制需求。评价结果表明：作为饮用水源的黑河水，肠道病毒是具有最大风险的肠道病原体，以10-4／a作为可接受年风险，在肠道病毒去除率为6-log的条件下，可以保障水质安全性大于90％。作为景观娱乐水体的兴庆湖和北湖，肠道病毒仍是最大风险肠道病原体，当肠道病毒的去除率达到4-log时，水质安全性在90％以上。浐河的肠道病原体风险的主要来源是多方面的，若直接作为景观用水，则志贺菌和大肠埃希菌造成的健康风险高于肠道病毒，但由于肠道病原菌与肠道病毒分布的差异，当它们的去除率都为4-log时，与肠道病毒相关的水质安全性仍然较低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 水传播疾病和病原体概述
• 1.1.1 水传播疾病的现状
• 1.1.2 水环境中的病原体
• 1.2 病原体在水环境中的存活和分布
• 1.2.1 影响病原体存活的因素
• 1.2.2 病原体在各种水体中的分布
• 1.2.3 病原体与指示物的关系
• 1.3 我国的水传播疾病和水环境病原性污染状况
• 1.3.1 我国主要的水传播疾病
• 1.3.2 我国的水环境病原性污染状况
• 1.4 环境水体中病原体的浓缩和检测技术概况
• 1.4.1 病原体浓缩技术
• 1.4.2 病原体检测技术
• 1.5 病原体健康风险评价的研究现状
• 1.5.1 环境风险评价的概念和分类
• 1.5.2 健康风险评价的发展
• 1.5.3 病原体健康风险评价的步骤和标准
• 1.6 研究目的与内容
• 1.6.1 问题的提出
• 1.6.2 研究目的
• 1.6.3 研究内容
• 1.6.4 技术路线
• 2 环境水体中肠道病毒浓缩方法的建立
• 2.1 病毒在滤膜上的吸附-洗脱机理
• 2.2 试验材料和计算方法
• 2.2.1 参考病毒株
• 2.2.2 主要试剂和设备
• 2.2.3 病毒回收率的计算
• 2.3 微孔滤膜吸附-洗脱法的建立
• 2.3.1 方法的流程
• 2.3.2 微孔滤膜孔径对病毒浓缩的影响
• 2.3.3 微孔滤膜材质对病毒浓缩的影响
• 2.3.4 洗脱方式的改进与洗脱剂的比较
• 2.3.5 洗脱液浓缩方法的比较与选择
• 2.3.6 PEG对病毒回收率的影响
• 2.3.7 浓缩方法与各步骤病毒回收率的确定
• 2.4 病毒浓缩方法的比较
• 2.4.1 滑石粉-硅藻土絮凝沉淀法
• 2.4.2 化学絮凝沉淀法
• 2.4.3 滑石粉-硅藻土吸附层吸附-洗脱法
• 2.5 微孔滤膜吸附-洗脱法对环境水样的适应性
• 2.6 小结
• 3 肠道病毒RT-PCR检测方法的建立
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 参考病毒株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.2 肠道病毒RT-PCR检测方法的建立
• 3.2.1 肠道病毒通用引物设计
• 3.2.2 RNA的提取
• 3.2.3 RT-PCR反应步骤的选择
• 3.2.4 RT-PCR反应体系的优化
• 3.2.5 首轮PCR的灵敏度与实际问题
• 3.2.6 肠道病毒巢式RT-PCR检测方法
• 3.3 小结
• 4 肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
• 4.1 实时荧光定量PCR的特征值含义和定量的数学原理
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 参考病毒株和主要试剂
• 4.2.2 仪器设备
• 4.3 实时荧光定量RT-PCR标准品的构建
• 4.3.1 试剂准备
• 4.3.2 感受态细胞的制备
• 4.3.3 PCR扩增产物的回收
• 4.3.4 克隆的筛选和重组质粒标准品的制备
• 4.4 实时荧光定量RT-PCR体系的优化
• 4.4.1 各组分浓度的优化
• 4.4.2 扩增循环参数的优化
• 4.4.3 标准曲线的测定及方法学评价
• 4.5 小结
• 5 典型肠道病原菌PCR检测方法的建立
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 参考菌株
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 仪器设备
• 5.2 环境水体样品的病原菌浓缩方法
• 5.3 伤寒沙门菌PCR检测方法的建立
• 5.3.1 伤寒沙门菌引物性质
• 5.3.2 伤寒沙门菌常规PCR检测方法
• 5.3.3 伤寒沙门菌实时荧光定量PCR检测方法
• 5.4 志贺菌PCR检测方法的建立
• 5.4.1 志贺菌引物性质
• 5.4.2 志贺菌常规PCR检测方法
• 5.4.3 志贺菌实时荧光定量PCR检测方法
• 5.5 大肠埃希菌PCR检测方法的建立
• 5.5.1 大肠埃希菌引物性质
• 5.5.2 大肠埃希菌常规PCR检测方法
• 5.5.3 大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法
• 5.6 霍乱弧菌PCR检测方法的建立
• 5.6.1 霍乱弧菌引物性质
• 5.6.2 霍乱弧菌常规PCR检测方法
• 5.6.3 霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测方法
• 5.7 小结
• 6 水环境中肠道病原体分布变化规律及相关因素研究
• 6.1 试验材料与方法
• 6.1.1 采样点的布设及水体基本状况
• 6.1.2 采样方法和监测时间
• 6.1.3 PCR检测
• 6.1.4 细菌学指标的培养法检测
• 6.1.5 理化指标的测定
• 6.1.6 检测结果处理分析方法
• 6.2 结果分析与讨论
• 6.2.1 各水体中肠道病毒的分布特征和变化规律
• 6.2.2 各水体中肠道病毒的类型
• 6.2.3 各水体中细菌的分布特征和变化规律
• 6.2.4 理化因子的变化规律
• 6.2.5 微生物学指标之间的关系
• 6.2.6 微生物指标与理化因子的关系
• 6.3 小结
• 7 水环境肠道病原体健康风险评价
• 7.1 水体病原性污染情况及危害鉴别
• 7.1.1 地表水环境质量标准存在的不足
• 7.1.2 病原体危害鉴别
• 7.2 不同使用方式的暴露评价
• 7.3 病原体剂量反应关系的确定
• 7.4 肠道病原体健康风险计算
• 7.4.1 肠道病原体分布参数
• 7.4.2 假设条件以及可接受年风险值的选取
• 7.4.3 健康风险的计算方法
• 7.5 肠道病原体健康风险与水质安全性评价
• 7.5.1 黑河
• 7.5.2 兴庆湖
• 7.5.3 北湖
• 7.5.4 浐河
• 7.5.5 二级处理出水
• 7.6 不确定性因素分析
• 7.7 小结
• 8 结论与建议
• 8.1 结论
• 8.2 本论文的创新点
• 8.3 建议
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及所获奖励