奶牛热应激的细胞免疫调控及其分子机理研究

论文题目: 奶牛热应激的细胞免疫调控及其分子机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 蔡亚非

导师: 王根林

关键词: 热应激,荷斯坦奶牛,淋巴细胞,免疚调控,原核表达

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究目的在于揭示与奶牛热应激相关的细胞免疫调控及分子机理。通过全血自动分析仪分析热应激奶牛外周的各项生理指标;流式细胞术分析热应激奶牛外周淋巴细胞的细胞周期及凋亡率;半定量RT-PCR分析外周淋巴细胞HSP70mRNA、HSF1mRNA、BC1-2mRNA和Bax-αmRNA基因表达水平;荧光定量PCR分析Bax-αmRNA基因表达;PCR-SSCP技术分析HSP70基因5’-侧翼区SNPs;pET-32a-c（+）表达bHSP70蛋白,并分析了了bHSP70生物活性。研究结果如下: 1 热应激对奶牛外周血各项生理指标的影响全自动血细胞分析仪分析日平均气温分为37.5℃（高温）、26.5℃（临界高温）和5.5℃（对照）条件下奶牛外周白细胞总数（White blood Cell,WBC）、淋巴细胞总数（lymphocyte,LYMPH）、中性粒细胞（granulocyte,GRAN）、单核细胞（mid-cell,MID）、淋巴细胞百分比（LYMPH%）、单核细胞百分比（MID%）、中性粒细胞百分比（GRAN%）、红细胞计数（red blood cell,RBC）、血红蛋白含量（hemoglobin,HGB）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume,MCV）、红细胞比积（hematocrit,HCT）、平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC）、红细胞分布宽度（red cell distribution width,RDW）、血小板计数（platelet count,PLT）、平均血小板体积（mean platelet volume,MPV）及血小板比积（platelet-crit,PCT）,等各指标的变化规律。研究发现白细胞计数（White blood cell,WBC）（14.75×109/L）和红细胞计数（red blood cell,RBC）(3.85×1012/L)在高温37.5℃时最低,随温度下降而逐步上升。RBC和血红蛋白（hemoglobin,HGB）在37.5℃最低,随温度降低逐步升高,相对于其它两个温度差异显著;红细胞平均血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）在26.5℃最高（18.82pg）,相对于其它温度差异显著。红细胞平均血红蛋白浓度（mean Corpuscular hemoglobin concentration,MCHC）和MCH水平在高温下明显高于对照组。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一篇文献综述

一、HSP70分子伴侣系统

1 分子伴侣(molecullar champerone)

2 分子伴侣的分类

3 热休克蛋白的发现

4 HSP70家族的基因定位及基因特性

5 HSP70蛋白的结构

6 HSP70蛋白的功能

7 HSP70分子伴侣系统

8 多肽结合功能域结合底物的专一性

9 HSP70的作用机理

10 HSP70和HSP90蛋白共同组成蛋白折叠的中继站

11 展望

二、Hsp蛋白与细胞凋亡

1 Hsps与细胞凋亡

2 HSPs与Fas死亡受体途径

3 HSPs与JNK／SAPK途径

4 HSPs与caspase酶途径

三、HSF的结构与功能

1 HSF的发现

2 HSF的类别与功能

3 HSF的结构

4 HSF活化过程

5 HSF的调节

6 现状与展望

四、有关奶牛热应激细胞免疫调控及分子机理研究进展

1 热应激对奶牛生产性能的影响

2 奶牛热应激的基因调控

3 奶牛热应激的基因调节的研究中存在的问题

参考文献

第二篇实验研究

实验一、热应激对奶牛外周血液学影响

1 材料和方法

1．1 实验动物

1．2 血常规分析

1．3 数据分析

2 结果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

实验二、热应激对奶牛外周血淋巴细胞周期及凋亡的影响

1 材料和方法

1．1 实验动物

1．2 流式细胞仪分析热应激奶牛淋巴细胞凋亡率、细胞周期及增殖指数

1．3 数据分析

2 结果

3 讨论

3．1 细胞凋亡流式检测的方法的优缺点

3．2 高温对淋巴细胞的凋亡率及细胞分裂周期的影响

参考文献

实验三、热应激奶牛外周淋巴细胞凋亡相关基因的表达

1 材料和方法

1．1 实验动物

1．2 实验试剂

1．3 主要设备及分析软件

1．4 实验方法

1．4．1 血样的采集

1．4．2 淋巴细胞的分离

1．4．3 总RNA的提取

1．4．4 RT反应

1．4．5 引物的设计

1．4．6 半定量PCR条件的优化

2 结果与分析

2．1 RNA质量

2．2 RNA的反转录效果的鉴定

2．3 各基因的基因扩增的循环圈数的摸索

2．4 内标18s rRNA引物与竞争物(Competimer)比例

2．5 不同温度条件下HSP70mRNA，HSF1mRNA，Bcl-2mRNA及Bax-αmRNA表达水平

3 讨论

3．1 相对定量RT-PCR条件的优化

3．2 高温对外周血淋巴细胞HSP70mRNA，HSF1mRNA，Bcl-2mRNA及Bax-αmRNA表达水平的影响及基因的互作

参考文献

实验四、热应激奶牛外周淋巴细胞bax-αmRNA的荧光定量PCR分析

1 材料和方法

1．1 材料和实验动物

1．2 总RNA的提取

1．4 引物的设计

1．5 荧光定量PCR分析初始bax-α基因表达量

2 结果

2．1 bax-α的熔解曲线

2．2 Bax-α基因定量

3 讨论

参考文献

实验五、HSP70启动子区SNPs与奶牛外周淋巴细胞凋亡相关基因表达的相关性

1 材料和方法

1．1 实验动物

1．2 奶牛血液基因组DNA的提取

1．3 聚丙烯酰胺凝胶制备

1．4 银染

1．5 HSP70 5’-侧翼区的基因多态性分析、测序及突变位点分析

1．6 分析不同基因型奶牛外周血淋巴细胞凋亡率及凋亡相关基因的表达

2 结果

2．1 HSP70 5’-侧翼区的基因调控区分析

2．2 HSP70 5’-侧翼区基因多态性研究

2．3 四种带型奶牛PCR产物序列比较分析

2．4 高温下不同基因型奶牛HSP70mRNA，HSF1mRNA，Bcl-2mRNA，Bax-αmRNA和Bcl-2mRNA／Bax-αmRNA基因表达的差异

2．5 流式细胞仪分析各基因型奶牛日平均气温37.5℃下外周血淋巴细胞的凋亡率

3 讨论

3．1 HSP70基因启动区SNPs的研究意义

3．2 奶牛热应激分子标记的初步筛选研究

参考文献

实验六、牛源HSP70基因克隆、测序、点突变、分子进化、pET32a-c(+)原核表达及活性检测

1 材料和方法

1．1 DNA提取

1．2 bHSP70基因的克隆

1．3 将目的基因bHSP70连接到pGEM(?)-T Easy Vector上(TA克隆)

1．4 DNAstar2.0软件分析

1．5 设计有粘性接头的引物扩增bHSP70基因

1．6 pET32a-c(+)载体的制备(具有粘性接头)

1．7 bHSP70基因双酶切

1．8 pET32a-c(+)-bHSP70重组质粒的构建

1．9 重组pET32a-c(+)-bHSP70质粒转化DE3(BL21)菌

1．10 IPTG诱导bhsp70重组蛋白的表达与SDS-PAGE电泳

1．11 免疫印记(Western-blot)检测rbHSP70重组蛋白

1．12 重组bHSP70生物活性的检测

2 结果

2．1 HSP70基因的克隆

2．2 HSP70的开放阅读框点突变发现及其对蛋白质特性的影响

2．3 HSP70家族蛋白的序列与分子的进化分析

2．4 pET-32a-c(+)-bHSPT0原核表达载体的构建

2．5 IPTG诱导重组质粒pET-32a-c(+)-bHSP70的DE3转化子重组蛋白的表达

2．6 重组bHSP70生物活性的检测

3 讨论

3．1 牛源HSP70基因的克隆及其在分子进化上的意义

3．2 牛源HSP70基因原核表达及意义

参考文献

全文结论

全文创新

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

发布时间: 2005-07-19

参考文献

[1].产甘油酵母培养物缓解奶牛热应激的作用及机理研究[D]. 刘瑾.南京农业大学2014
[2].加减白虎汤散剂缓解奶牛热应激的效果及其机理研究[D]. 郑会超.浙江大学2013

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