猪源致病性大肠杆菌药敏检测及复方安普霉素、多西环素抗菌制剂研究

论文摘要

本研究对采自四川、重庆、湖北等21个省市规模化猪场的大肠杆菌病疑似病例粪样,进行了大肠杆菌的分离纯化,根据细菌生长特性以及革兰氏染色和镜检结果,初步判定得到大肠杆菌共737株。从各省市随机抽取分离株进行生化鉴定和致病性试验,得到105株致病性大肠杆菌。采用临床常用5大类共15种抗生素,对致病株进行药敏检测。结果显示敏感率较高的是安普霉素（81.9%）,多粘菌素B（80%）,其次是氟苯尼考（70.5%）,大观霉素（63.8%）;敏感率在20%以下从低至高依次为四环素（0%）,氨苄青霉素（3.8%）,恩诺沙星（5.7%）,阿莫西林/棒酸（6.7%）,多西环素（8.6%）,链霉素（9.5%）,环丙沙星（18.1%）。105株致病株中6重以上（包括6重）耐药的菌株占85.71%,其中5株菌对15种受试药物全部耐药;无菌株只对1种抗生素耐药。对多重耐药株的分布进行分析,发现四川、重庆、河南、福建、安徽、甘肃、辽宁及广东抽检菌株未见有低于6重耐药株。基于药敏检测的结果和安普霉素的特点,以其作为主药,选择药敏调查中敏感率较高,且理论上与安普霉素呈协同或相加效应的抗生素或抗菌增效剂,与其进行联合药敏试验,在6种药物配伍中,多西环素与安普霉素表现出最强的协同作用。对安普霉素、多西环素及载体设计3因素4水平正交试验,确定三者的最佳配比为2:1:2。用大肠杆菌0149标准菌株,5株高耐致病株和10株随机抽取的致病株对配方进行抑菌效果验证,得到所选配方对试验菌株的MIC比安普霉素降低2～4倍;比多西环素降低2～16倍;比同配比安普霉素、多西环素双药组合降低1～4倍。采用改良寇氏法测定所得复方对小鼠的半数致死量,结果显示该复方的LD50为2.16 g/kg,LD50的95%可信限为1.70～2.74 g/kg,属于低毒外源化学物。对试验组小鼠的体重与对照组进行方差分析,得到除灌服量为777.6 mg/kg的实验组3天后的体重显著高于对照组外,其余各组与对照组无显著性差异。对复方药物的含量分析方法进行了试验,得到了以甲醇处理,再分别用微生物法和高效液相色谱法测定安普霉素和多西环素的含量分析方法。试验表明该方法具有良好的专属性、精密度、回收率和重现性。对复方制剂完整处方中的辅料以及包装进行了优化,设计以原药、赋形剂（可溶性淀粉,以葡萄糖对照）和抗结块剂（二氧化硅）作为影响因素的3因素2水平正交试验,分别以塑料袋、铝箔袋和西林瓶包装,结果在加速实验一个月后葡萄糖对照组及可溶性淀粉组中的塑料袋包装组均出现结块变色现象,而其余组在3因素不同用量水平下无明显差异。对复方制剂进行了稳定性试验,结果表明样品在强光照条件下放置10天,在温度40±2℃,相对湿度75±5%的条件下放置6个月及在温度25±2℃,相对湿度60±5%的条件下放置12个月,各项指标均符合质量标准规定,具有较好的稳定性。本研究得到一种复方安普霉素、多西环素可溶性粉剂配方,并依照新兽药申报要求,进行了相关试验,为临床对猪大肠杆菌病的防治提供了一种新型安全高效的抗菌制剂。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 猪大肠杆菌病的研究进展
• 1.2 猪源大肠杆菌耐药性研究进展
• 1.3 防治猪大肠杆菌病制剂研究进展
• 1.4 安普霉素研究与应用进展
• 1.5 多西环素研究与应用进展
• 1.6 本研究目的意义与创新点
• 2 试验材料
• 2.1 实验菌株
• 2.2 实验动物
• 2.3 药品试剂
• 2.4 实验器材
• 3 试验方法
• 3.1 猪源大肠杆菌分离鉴定
• 3.1.1 分离纯化
• 3.1.2 生化鉴定
• 3.2 猪源大肠杆菌致病性试验
• 3.3 猪源致病性大肠杆菌药敏检测
• 3.4 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂配方筛选
• 3.4.1 联合药敏试验
• 3.4.2 药物正交试验
• 3.4.3 配方验证试验
• 3.5 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂急性毒性试验
• 3.5.1 急性毒性预试验
• 50的测定'>3.5.2 急性毒性试验LD₅₀的测定
• 3.6 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂含量分析方法研究
• 3.6.1 安普霉素含量测定方法研究
• 3.6.2 多西环素含量测定方法研究
• 3.7 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂完整处方和稳定性研究
• 3.7.1 完整处方研究
• 3.7.2 稳定性研究
• 4 试验结果
• 4.1 猪源大肠杆菌分离鉴定结果
• 4.1.1 分离纯化结果
• 4.1.2 生化鉴定结果
• 4.2 猪源大肠杆菌致病性试验结果
• 4.3 猪源致病性大肠杆菌药敏检测结果
• 4.3.1 药敏检测结果
• 4.3.2 多重耐药分析结果
• 4.4 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂配方筛选结果
• 4.4.1 联合药敏试验结果
• 4.4.2 药物正交试验结果
• 4.4.3 配方验证试验结果
• 4.5 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂急性毒性试验结果
• 4.5.1 急性毒性预试验
• 50的测定'>4.5.2 急性毒性试验LD₅₀的测定
• 4.6 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂含量分析方法研究结果
• 4.6.1 安普霉素含量测定方法研究
• 4.6.2 多西环素含量测定方法研究
• 4.7 复方安普霉素、多西环素抗菌制剂完整处方和稳定性研究结果
• 4.7.1 完整处方研究
• 4.7.2 稳定性研究
• 5 讨论
• 5.1 关于猪致病性大肠杆菌耐药性
• 5.2 关于联合药敏试验
• 5.3 关于配方验证试验
• 5.4 关于复方制剂急性毒性试验
• 5.5 关于含量分析方法研究
• 5.6 关于复方制剂稳定性研究
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文