酿酒酵母Cdc25p在Ras-cAMP通路调节中的功能研究

论文摘要

向解除葡萄糖抑制的酵母细胞中（在非发酵碳源上生长或进入稳定期的细胞）加入葡萄糖对胞内合成cAMP产生刺激性的作用,使胞内cAMP水平短暂快速升高,依赖cAMP的蛋白激酶A（PKA）被激活,胞内发生蛋白磷酸化级联反应。葡萄糖作为信号分子由Cdc25/Ras/adenylyl cyclase信号通路介导,在这条信号通路中,Cdc25p是Rasp的鸟苷酸交换因子（GEF）,其功能是催化Rasp的GDP/GTP交换反应。已有研究表明:Cdc25p是一种磷酸化蛋白,葡萄糖诱导后,PKA被激活并将Cdc25p超磷酸化修饰;Cdc25p被磷酸化修饰后定位由胞膜向胞质迁移,与膜上Rasp的结合减弱。所有这些结果均表明:Cdc25p可能是PKA对胞内cAMP水平反馈抑制的靶标之一。但是,目前为止还没有证据证明Cdc25p的磷酸化修饰可以减弱其GEF活性,进而从合成水平上反馈抑制Ras-cAMP信号通路。本论文的主要内容是研究酿酒酵母PKA通过磷酸化修饰Cdc25p来反馈抑制Ras-cAMP信号通路的作用机制,通过体外实验证明了Cdc25p被磷酸化修饰后,其对Rasp的GEF活性减弱。同时,还对不同TPK基因产物通过磷酸化Cdc25p对Ras-cAMP信号通路的反馈抑制作用进行研究。实验结果表明:PKA通过磷酸化修饰Cdc25p对Ras-cAMP信号通路反馈抑制,且这种反馈抑制作用并不依赖于Yak1, Tor1, Rim15, Sch9激酶。在酿酒酵母细胞中,BCY1基因编码PKA的调节亚基,TPK1, TPK2和TPK3基因编码催化亚基。首先,我们构建不同PKA活性的突变株:敲除BCY1基因,并保留一个或两个TPK基因的突变株PKA活性高;同时敲除三个TPK基因和YAK1基因的突变株PKA活性低。实验结果表明:高PKA活性的突变株中,Cdc25p被超磷酸化修饰,胞内Ras2-GTP相对含量低,且单位质量Cdc25p结合的Ras2-GTP少;反之,低PKA活性的突变株中,Cdc25p不能被磷酸化修饰,胞内Ras2-GTP相对含量高,且单位质量Cdc25p结合的Ras2-GTP多。这些结果表明:酿酒酵母PKA对Ras-cAMP信号通路的反馈抑制机制之一是通过PKA对Cdc25p的磷酸化修饰从合成水平上反馈抑制Ras-cAMP信号通路。体外实验结果表明:Cdc25p被磷酸化修饰后,其对Rasp的GEF活性减弱,揭示了PKA通过磷酸化修饰Cdc25p对Ras-cAMP信号通路反馈抑制的机制。实验结果还表明:敲除BCY1基因后,三个TPK基因产物也分别能磷酸化修饰Cdc25p,并使胞内Ras2-GTP相对含量低,单位质量Cdc25p结合的Ras2-GTP少。由此揭示:在解除了BCY1基因产物对TPK基因产物的负调控作用后,TPK基因产物磷酸化修饰Cdc25p,从合成水平上反馈抑制Ras-cAMP信号通路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 细胞信号转导概述
• 1.2 G蛋白
• 1.3 酿酒酵母的cAMP 信号通路
• 1.3.1 酿酒酵母Ras-cAMP 信号通路的组成元件
• 1.3.2 Ras /cAMP/PKA 的下游靶标
• 1.4 蛋白质可逆磷酸化对信号转导的调节方式及意义
• 1.5 Ras-cAMP通路的生理功能
• 1.5.1 葡萄糖诱导的cAMP信号途径的激活对碳代谢的影响
• 1.5.2 葡萄糖激活cAMP信号通路的生理作用
• 1.5.3 酿酒酵母Ras-cAMP信号通路的反馈抑制作用
• 1.6 FGM途径
• 1.7 Ras-cAMP 途径/PKA 活性和酵母细胞周期的调控
• 1.8 酵母细胞的时序寿命
• 1.9 本研究的目的和内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法（CTAB法）
• 2.2.3 酵母染色体的快速分离
• 2.2.4 PCR扩增反应
• 2.2.5 DNA的限制酶消化
• 2.2.6 DNA的限制酶切位点补平
• 2.2.7 DNA的连接反应
• 2.2.8 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.9 从琼脂糖中回收DNA
• 2.2.10 酵母细胞的转化方法
• 2.2.11 一步基因置换法缺失目的基因
• 2.2.12 两步基因置换法融合3*HA标签
• 2.2.13 酵母交配型的验证
• 2.2.14 不同交配型酵母细胞之间的杂交
• 2.2.15 产孢及四分体孢子拆分
• 2.2.16 Dilution实验方法
• 2.2.17 水浴热击实验方法
• 2.2.18 蛋白质浓度的定量（Bio-Rad方法）
• 2.2.19 玻璃珠法提取酿酒酵母总蛋白
• 2.2.20 免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）
• 2.2.21 蛋白质的磷酸酶处理
• 2.2.22 免疫沉淀蛋白的洗脱
• 2.2.23 大肠杆菌BL21 中融合蛋白的诱导表达及总蛋白的超声提取
• 2.2.24 Sepharose Beads-GSH纯化融合蛋白
• 2.2.25 融合蛋白GST-Ra52 的纯化与洗脱
• 2.2.26 Thrombin Protease处理融合蛋白GST-Ra52p
• 2.2.27 体外Rasp的GDP/GTP loading
• 2.2.28 体外Rasp的GDP/GTP exchange
• 2.2.29 亲合产物与酵母总蛋白中Ra52-GTP的Pulldown
• 2.2.30 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 2.2.31 Western blot蛋白免疫实验
• 第三章 Ras/PKA活性对Cdc25p磷酸化的影响
• 3.1 概述
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 葡萄糖诱导使Cdc25p磷酸化
• 3.2.2 PKA活性对Cdc25p磷酸化的影响
• 3.2.3 其他激酶对Cdc25p磷酸化的影响
• 3.3 本章小结
• 第四章 Cdc25p磷酸化对其GEF活性的影响
• 4.1 概述
• 4.2 实验结果与讨论
• 4.2.1 体内Cdc25p磷酸化对Ra52p活性的影响
• 4.2.2 体外实验证明Cdc25p的磷酸化修饰对Ra52p的GEF活性的影响
• 4.3 本章小结
• 第五章 不同TPK基因产物在Cdc25p介导的反馈抑制Ras-cAMP信号通路中的作用
• 5.1 概述
• 5.2 实验结果与讨论
• 5.2.1 菌株的构建
• 5.2.2 TPK基因编码产物对Cdc25p的磷酸化
• 5.2.3 TPK基因编码产物对Ras-cAMP信号通路的反馈抑制
• 5.3 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 工作总结
• 6.2 相关工作展望
• 参考文献
• 附录1 生化名词缩写
• 附录2 基因及其相应编码产物
• 致谢