论文摘要
目的采用基因点突变技术构建两种CD59突变基因并重组入真核表达质粒,通过转基因技术建立高效真核表达系统,观测细胞表面野生型CD59与突变型CD59分子的表达情况,探讨CD59抗补体活性变化,推断W40位点及邻近氨基酸的生物学活性,以初步揭示CD59分子在肿瘤逃逸中的作用,为肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法选取物种间高度保守W40位点基因及相邻碱基为突变位点,构建两种不同的基因突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变（M1）,另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变（M2）,采用Overlap extension PCR法诱导CD59点突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59cDNA为模板,3重PCR定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切后,突变基因重组入真核表达载体pIRES。利用阳离子脂质体（Lipfectamine2000）将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）进行表达。G418筛选稳定转染细胞克隆,核酸原位杂交检测CD59mRNA的表达,荧光免疫组化、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹技术检测筛选CD59突变基因蛋白高表达株,染料释放试验与台盼蓝染色试验检测和比较野生型与突变型CD59蛋白抗补体活性的不同。结果通过PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定均证实成功构建了pIRES-M1CD59、pIRES-M2CD59重组真核表达载体系统,突变基因长度约500bp。核酸原位杂交显示CD59mRNA的表达,免疫荧光、ELISA、Western-blot验证CD59的表达,传代30代,仍可测到蛋白表达;荧光染料释放试验和台盼蓝染色试验研究显示与野生型CD59相比,突变型M1CD59失去对补体的抑制功能,而突变型M2CD59对补体的抑制作用较强。结论:1.采用基因点突变和基因重组技术成功构建两种突变CD59重组质粒。2.通过转基因技术将重组质粒pIRES-M1CD59和pIRES-M2CD59导入CHO细胞,建立稳定真核表达系统。3.CD59的W40位点是CD59分子重要的抗补体活性位点,提示封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤靶向治疗。