微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究

论文摘要

多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是指含两个或两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸,主要有亚油酸（Linoleic acid,LA）、γ-亚麻酸（γ-Linolenic acid,GLA）、花生四烯酸（Arachidonic acid,ARA）、α-亚麻油（α-Linolenic acid,ALA）、廿碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）和廿二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）等。多不饱和脂肪酸大多数是生物活性物质的前体,尤其是对智力发育、心血管病等有良好效果。此外PUFAs还可用作食品添加剂、营养配方、健康辅料以及保健品等。微生物所具有的营养简单、生长繁殖快、易变异、可工业化大规模培养的优点决定了利用微生物生产油脂是一条开发新油源的良好途径。目前国内外研究通常利用葡萄糖、淀粉和蔗糖等作为碳源生产多不饱和脂肪酸。作者试图从土壤中筛选出以甘蔗糖蜜为碳源,发酵生产多不饱和脂肪酸的菌株,并对菌株进行诱变育种,发酵条件,代谢调控,油脂的分离提取和富集等方面进行研究,以及利用气相色谱进行油脂组成和含量鉴定分析。本研究的结果如下:1、利用苏丹黑B染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法,从土壤中筛选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌LB1。对LB1菌株进行形态特征、生理特征分析及5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙进行序列分析推断该菌株为反屈毛霉属（Mucor recurvus）。2、以土壤筛选到的反屈毛霉LB1为出发菌株,通过60Co辐射复合LiCl诱变,进行富含多不饱和脂肪酸菌株的选育。菌种的筛选主要以含脂量以及碘值的高低作为选择菌株的依据,筛选到一株不饱和脂肪酸高产菌株MR-10,较原始菌株总脂含量增加35.42%,碘值增加36.56%,PUFAs增加43.76%。将筛选出的菌株分别进行遗传稳定性测试表明,菌株经过五次转代培养,具有较好的遗传稳定性。3、在反屈毛霉LB1发酵条件优化的实验中,探讨了不同碳源:葡萄糖、蔗糖、淀粉以及PDA等对发酵的影响。从结果和糖蜜的成分分析以及经济角度考虑,糖蜜可以作为发酵生产多不饱和脂肪酸的碳源,且糖蜜的最佳浓度为15%。同时确定尿素为最佳氮源,最佳C/N比为35/1。通过单因子试验和正交实验,得到发酵生产不饱和脂肪酸的最佳培养条件为:培养温度25℃,摇床转速160 rpm,培养时间5天。在上述条件下,反屈毛霉LB1发酵可得生物量、总脂量和PUFAs产量分别达到12.51 g/L,7.13 g/L和5.74 g/L。4、在反屈毛霉LB1发酵代谢调控中,在发酵过程中补加十八醇、十六醇和正丁醇前体物,得出补加十六醇可以提高菌丝的油脂和不饱和脂肪酸含量。在发酵24小时后补加1.5%的十六醇,可获得最大的油脂含量8.24 g/L;碘值113.84,PUFAs 6.96 g/L。培养基中添加适量浓度金属离子Mg2+可以提高菌丝多不饱和脂肪酸的产量,当MgSO4在20-30 mmol/L范围内,生物量、油脂含量、碘值及PUFAs随MgSO4的增加而增加。当Mg2+浓度为30 mmol/L时,油脂含量6.62 g/L;碘值109.10,PUFAs 5.16 g/L。高于30 mmol/L时,生物量、油脂含量、碘值及PUFAs有所下降,说明高浓度的金属离子对发酵生产有抑制作用。在培养中添加适量的维生素可以提高油脂中PUFAs的含量,但对生物量影响不大。维生素B1和维生素B6作为油脂生物合成过程中合成酶的辅助因子,在不饱和脂肪酸的形成起到重要作用。维生素的添加量也有一定的影响,随添加维生素浓度的增加,油脂的碘值和PUFAs有所增加,维生素B1添加量为0.20 mg/mL较为合适,而维生素B6 0.25 mg/mL为适宜,说明高浓度维生素对不饱和脂肪酸的积累有利。代谢调控中低温老化是增加不饱和脂肪酸产量的一种有效方法,反屈毛霉LB1在5℃储存15天后,油脂含量由5天的5.18 g/L到5.72 g/L,PUFAs由3.37 g/L到4.60 g/L。利用低温和老化的共同作用可以提高不饱和脂肪酸的含量。5、在石油醚萃取,正己烷萃取和盐酸水解乙醚抽提等三种油脂分离提取方法中,采用盐酸水解乙醚抽提方法为本研究油脂提取方法,多不饱和脂肪酸富集部分采用尿素包合-冷冻结晶法进行。研究表明当混合酸:乙醇:尿素=1:1.5:7.5时,富集效果最佳。在此条件下富集,微生物油脂中的碘值从原来的91.20提高到102.45,油脂的不饱和度提高了12.35%。6、采用菌体直接进行油脂的甲酯化方法,通过气相色谱分析油脂和不饱和脂肪酸的组成和含量。通过样品和标品气相色谱出峰及保留时间的对照,利用面积归一化计算,得出菌株的油脂含量为7.13 g/L,不饱和脂肪酸含量达到5.74 g/L。其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为:油酸885mg/L,亚油酸825 mg/L、γ-亚麻酸1352 mg/L、α-亚麻酸176 mg/L、花生四烯酸567 mg/L、廿碳五烯酸467 mg/L、廿二碳六烯酸348 mg/L。7、价格低廉的甘蔗糖蜜含有丰富的糖类、氮源、无机盐及维生素等物质,可代替葡萄糖、蔗糖和淀粉等作为微生物发酵生产多不饱和脂肪酸的原料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 多不饱和脂肪酸的研究概况
• 1.2 微生物产脂肪酸的种类及其生理功能
• 1.2.1 亚油酸（linoleic acid LA）
• 1.2.2 γ—亚麻酸（GLA）
• 1.2.3 花生四烯酸（AA）
• 1.2.4 二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）
• 1.3 PUFAs主要应用
• 1.3.1 医药用品
• 1.3.2 食品工业
• 1.3.4 其他应用
• 1.4 产PUFAs的微生物
• 1.5 微生物油脂产生的机理
• 1.6 不饱和脂肪酸的产生机理及去饱和酶的研究
• 1.7 影响微生物合成油脂的重要因素
• 1.7.1 碳源的影响
• 1.7.2 氮源的影响
• 1.7.3 培养基中C/N的影响
• 1.7.4 起始pH值的影响
• 1.7.5 通气与搅拌
• 1.7.6 培养温度
• 1.7.7 培养时间
• 1.7.8 接种量
• 1.7.9 无机盐及微量元素
• 1.8 微生物产PUFA的代谢调控育种
• 1.8.1 微生物细胞的调节机制
• 1.8.2 生物代谢调控发酵的基本思路
• 1.8.3 微生物代谢调控发酵育种的基本技术
• 1.8.4 微生物发酵生产多不饱和脂肪酸代谢调控育种
• 1.9 油脂提取方法的研究
• 1.10 PUFAs提取、富集方法的研究
• 1.10.1 低温冷冻结晶法
• 1.10.2 尿素包合法
• 1.10.3 分子蒸馏法
• 1.10.4 超临界CO2萃取法
• 1.10.5 吸附分离法
• 1.10.6 高效液相法
• 1.10.7 脂肪酶浓缩法
• 1.11 PUFAs的检测
• 1.12 存在问题和展望
• 1.13 理论意义
• 1.14 实际意义
• 1.15 本课题立题依据
• 第二章 糖蜜发酵生产PUFAs的菌种分离及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1.菌种的筛选
• 2.3.2 菌种鉴定
• 2.4 小结
• 第三章 生产PUFAs的诱变育种
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同氯化锂浓度对孢子的诱变作用
• 60Co的γ-辐射复合氯化锂诱变'>3.3.2⁶⁰Co的γ-辐射复合氯化锂诱变
• 60Co诱变结果'>3.3.3⁶⁰Co诱变结果
• 60Co辐射诱变遗传稳定性实验结果'>3.3.4⁶⁰Co辐射诱变遗传稳定性实验结果
• 3.4 小结
• 第四章 发酵条件优化研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不同碳源对反屈毛霉LB1生长和PUFAs合成的影响
• 4.3.2 糖蜜浓度的确定
• 4.3.3 氮源的确定
• 4.3.4 C/N的比率
• 4.3.5 接种量的确定
• 4.3.6 初始pH对发酵的影响
• 4.3.7 菌株产脂的最适时间
• 4.3.8 菌株产脂的最适温度
• 4.3.9 摇床转速及溶氧对菌株产脂量的影响
• 4.3.10 正交试验设计
• 4.4 小结
• 第五章 反屈毛霉（Mucor recurvus）生产PUFAs的代谢调控
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 前体物对发酵产多不饱和脂肪酸的影响
• 5.3.2 金属离子的影响
• 5.3.3 维生素的影响
• 5.3.4 老化对不饱和脂肪酸积累的影响
• 5.4 小结
• 第六章 不饱和脂肪酸分离提取、富集和鉴定的初步研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 三种方法提取反屈毛霉油脂的比较
• 6.3.2 尿素包合复合冷冻结晶方法浓缩富集PUFAs
• 6.3.3 菌株多不饱和脂肪酸的气相色谱分析
• 6.4 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.1.1 菌株的筛选和鉴定
• 7.1.2 菌株的诱变育种
• 7.1.3 菌株糖蜜发酵生产PUFAs的条件优化
• 7.1.4 菌株发酵过程的代谢调控
• 7.1.5 PUFAs分离提取、富集和成分组成鉴定
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1 主要药品
• 附录2、仪器设备
• 附录3、糖蜜处理技术路线
• 附录4、油脂的分离和不饱和脂肪酸的富集
• 附录5、脂肪酸碘值的测定
• 附录6、微生物油脂的气相色谱分析
• 攻读学位期间发表及已接收的学术论文
• 致谢