香菇交配型因子次级重组体及与交配型因子连锁的分子标记的鉴定

论文摘要

香菇（Lentinula edodes）是一种异宗结合的食用蕈菌，具有由两个不连锁的交配型因子（A和B）控制的四极性交配系统。本研究以13个香菇菌株为材料，采用培养基转换培养（OWE-SOJ技术）和核迁移试验等方法对各菌株孢子单核体交配型因子组合进行了准确鉴定，并对其中可能产生了次级重组体的HL01菌株进行了进一步的分析和验证。同时，采用随机扩增多态性DNA／集团分离析（RAPD／BSA）、代表性差异分析（RDA）和简并引物PCR等分子标记技术，搜寻、鉴定了与香菇交配型因子连锁的分子标记，并对所得标记的序列结构、基本属性等作了初步探讨。所得主要研究结果如下：在对供试13个香菇菌株进行常规交配型分析的基础上，采用OWE-SOJ技术和核迁移试验对各菌株孢子单核体的交配型因子组合进行了鉴定。结果表明，应用OWE-SOJ技术，可以观察到3种形态明显不同的菌落，即由A≠B≠配对形成的具锁状联合的绒毛状菌落、由A≠B=配对形成的无锁状联合的栅栏型菌落及由A=B≠配对形成的无锁状联合的绒毛状菌落。核迁移试验表明，核迁移仅出现于A=B≠反应中而不出现于A≠B=反应中。由于这两种方法均可清楚区分通常无明确形态差异的A=B≠和A≠B=反应，因此，用于香菇孢子单核体交配型因子的准确鉴定是行之有效的。在对上述13个香菇菌株进行交配型分析的过程中发现了一个表现特殊的菌株HL01。在其担孢子随机两两配对的132个组合中，不亲和组合与亲和组合之比为82：50，x2值为11.00，极显著地偏离不亲和组合与亲和组合之比为3：1的理论x2值。用4种标准测交菌株进行交配试验表明，在该菌株的189个供试担孢子中，有161个可分别归于4个标准测交菌株A1B1、A2B2、A1B2和A2B1所代表的4种正常交配型，但其余疑似次级重组的28个则不能归于其中任何一类。用两两配对法对这28个担孢子进一步进行交配型分析，鉴定出了A1B3、A1B4、A2B3、A2B4、A3B2和A3B5等6种交配型的单核体，表明HL01的A、B交配型因子内部均发生了重组。A、B因子的重组率分别为8.47％、11.64％；A因子至少含有2个亚单位，B因子则可能由不止2个亚单位构成。随后的结实试验显示，至少含有一个这些次级重组体的可亲和配对均具有结实能力。为鉴定与香菇交配型因子相关的分子标记，我们采用了RAPD／BSA、RDA和简并引物PCR等方法。其中，利用简并引物PCR获得了一条与香菇HL01菌株B2交配型因子共分离的DNA片段（773bp）。序列分析显示该片段属于信息素受体，表明香菇中B因子的遗传基础与两种模式蕈菌裂褶菌（Schizophyllum commune）和灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）是一样的。同时，利用简并PCR法得到香菇中MIP基因片段（419bp）。已证实在其它许多蕈菌中，MIP基因与A交配型因子是紧密连锁（＜1kb）的，因此，本研究利用简并PCR法所获得的香菇的MIP基因片段，为进一步证实香菇中A因子与MIP基因的连锁关系打下了初步的基础。最后，我们对已获得的B因子片段及MIP基因片段用TAIL-PCR和反向PCR方法进行了步移。对B2因子片段由773bp延长到3119bp，通过BLAST搜索GenBank中的类似序列，可以推定我们已经找到一个近乎完整的香菇B因子信息素受体基因组DNA序列。对MIP基因片段，则由449bp延长到2134bp，根据BLAST分析的结果可以推断在香菇中MIP基因与A交配型因子连锁的可能性是很大的，从而为A因子的克隆、测序等工作的开展奠定了较好的基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 香菇概述
• 1.1 营养经济价值
• 1.2 分类地位
• 1.3 资源分布
• 2 蕈菌的交配和不亲和性系统
• 2.1 蕈菌的交配系统
• 2.1.1 初级同宗结合
• 2.1.2 次级同宗结合
• 2.1.3 二极性异宗结合
• 2.1.4 四极性异宗结合
• 2.2 蕈菌的体细胞不亲和性
• 3 蕈菌交配型基因的研究进展
• 3.1 蕈菌交配型基因的定位
• 3.2 四极性蕈菌交配型基因的结构与功能
• 3.2.1 A交配型基因座位
• 3.2.2 B交配型基因座位
• 3.3 二极性蕈菌交配型基因的结构与功能
• 3.4 蕈菌交配型基因的克隆
• 3.4.1 通过功能互补法克隆交配型基因
• 3.4.2 通过染色体步移法克隆交配型基因
• 3.4.3 通过序列相似性克隆交配型基因
• 3.5 蕈菌交配型基因的起源
• 3.6 交配型基因的进化
• 3.7 蕈菌交配型因子的复等位现象
• 4 分子标记在蕈菌研究中的应用
• 4.1 分子标记的种类
• 4.1.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 4.1.2 简单重复序列（SSR）
• 4.1.3 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 4.1.4 代表性差异分析（RDA）
• 4.1.5 扩增片段长度多态性（AELP）
• 4.1.6 相关序列扩增多态性（SRAP）
• 4.1.7 靶位区域扩增多态性（TRAP）
• 4.2 分子标记在蕈菌研究中的应用
• 4.2.1 不同菌株遗传差异的鉴定
• 4.2.2 遗传多样性和亲缘关系的分析
• 4.2.3 杂交育种中亲本选择和杂交子的鉴定
• 4.2.4 基因定位和克隆及遗传连锁图谱构建
• 第二章 香菇孢子单核体交配型因子的准确鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试香菇双核菌株
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 试验所用仪器、设备
• 2.1.4 原生质体制备用试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 双核菌株的栽培
• 2.2.2 孢子印的获得
• 2.2.3 孢子单核体的制备
• 1和T₂'>2.2.4 原生质体单核化方法确定标准测交菌株T₁和T₂
• 3和T₄的确定'>2.2.5 标准测交菌株T₃和T₄的确定
• 2.2.6 单核体交配型的鉴定
• 2.2.7 OWE-SOJ技术
• 2.2.8 核迁移试验
• 3 结果与分析
• 1、T₂的确定'>3.1 原生质体单核体的鉴定及标准测交菌株T₁、T₂的确定
• 3、T₄的确定及孢子单核体交配型的常规分析'>3.2 标准测交菌株T₃、T₄的确定及孢子单核体交配型的常规分析
• 3.3 四类孢子单核体菌株交配型的准确鉴定
• 3.3.1 OWE-SOJ技术与交配型的准确鉴定
• 3.3.2 核迁移试验与交配型的准确鉴定
• 3.3.3 交配型鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 关于OWE-SOJ技术
• 4.2 关于核迁移试验
• 4.3 标准测交菌株法鉴定交配型
• 5 结论
• 第三章 香菇交配型因子次级重组体的鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 供试香菇菌株
• 2检验'>2.2 不亲和组合与亲和组合比值的x²检验
• 2.3 次级重组体交配型的鉴定
• 2.4 次级重组体结实性能考察
• 3 结果与分析
• 3.1 供试菌株交配型鉴定中不亲和与亲和配对的比例
• 3.2 次级重组体的鉴定
• 3.3 A、B交配型因子的亚单位组成
• 3.4 结实性能考查
• 4 讨论
• 4.1 交配型因子的次级重组
• 4.2 未来研究方向
• 5 结论
• 第四章 与香菇交配型因子连锁的分子标记的鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验所用仪器、设备
• 2.3 试验所用试剂
• 2.3.1 主要试剂及来源
• 2.3.2 贮存液
• 2.3.3 DNA提取液
• 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备试剂
• 2.3.5 质粒提取缓冲液
• 2.4 扩增反应的引物
• 2.4.1 RAPD（随机扩增多态性DNA）引物
• 2.4.2 RDA（代表性差异分析）引物
• 2.4.3 简并引物
• 2.5 试验方法
• 2.5.1 香菇基因组DNA的制备
• 2.5.2 BSA（集团分离分析）和RAPD
• 2.5.3 RDA
• 2.5.4 简并引物PCR
• 2.5.5 克隆与测序
• 2.5.6 SCAR标记验证
• 3 结果与分析
• 3.1 RAPD/BSA扩增及搜寻结果
• 3.2 RDA扩增及搜寻结果
• 2因子相关的特异片段'>3.3 简并引物PCR获取的与B₂因子相关的特异片段
• 2因子片段的获得'>3.3.1 B₂因子片段的获得
• 3.3.2 BLAST分析结果
• 3.3.3 次级重组体的分子证据
• 3.4 简并引物PCR获取的与MIP基因相关的特异片段
• 3.4.1 MIP基因片段的获得
• 3.4.2 BLAST分析结果
• 4 讨论
• 4.1 关于简并引物PCR
• 4.2 关于RAPD方法的局限性
• 4.3 关于RDA
• 5 结论
• 第五章 香菇B因子片段和MIP基因片段的染色体步移
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 反向PCR
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 模板的制备
• 2.2.3 PCR扩增条件
• 2.3 TAIL-PCR
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 PCR扩增条件
• 2.4 克隆与测序
• 3 结果与分析
• 3.1 对MIP基因片段的步移
• 3.1.1 用TAIL-PCR进行第一次步移
• 3.1.2 用TAIL-PCR进行第二次步移
• 3.1.3 用反向PCR进行第二次步移
• 3.1.4 对MIP片段步移的综合结果
• 3.1.5 生物信息学方法对MIP基因片段的分析
• 3.2 B因子片段的步移
• 3.2.1 步移结果
• 3.2.2 生物信息学方法对B因子片段的分析
• 4 讨论
• 4.1 关于反向PCR
• 4.2 关于TAIL-PCR
• 4.3 未来研究方向
• 5 结论
• 本论文主要创新点
• 参考文献（References）
• 致谢
• 在读期间已发表与课题相关的文章