STAT3和SOCS3对神经再生作用的研究

论文摘要

成熟的中枢神经系统（CNS）损伤后,损伤的轴突通常便失去了再生的能力。而成熟的周围神经系统（PNS）损伤后,在未伤及其靶组织的情况下,受损的轴突仍然能够成功再生。目前已经证实,造成中枢神经系统再生受限的主要障碍有两种。一种是不利于神经元细胞轴突生长的环境,其特点为髓鞘碎片,胶质瘢痕,空化以及易化分子缺乏。另一种是损伤的中枢神经系统神经元失去对有利于轴突再生的基因表达的控制。越来越多的证据表明,阻碍抑制信号的传导过程有利于克服中枢神经的再生障碍,但必须与激活神经细胞内在生长状态相结合,从而使轴突能够成功再生。背根神经节（DRGs）的初级感觉神经元大量聚集形成神经丛,成为适合对CNS以及PNS再生能力进行比较的细胞元群体。这些神经元同时具有中枢神经和外周神经的轴突。周围神经的神经支受损伤后,可表现出旺盛的再生能力,最终实现功能性恢复。与之相反,中枢神经的神经支损伤后,其轴突的再生能力较差。研究显示,将成年小鼠或大鼠的坐骨神经近端在其进一步损伤之前2-28天压碎或横断,轴突的再生能力增强,速度加快3倍。背柱横切后,伴随损伤而生长成为周围神经片段的背根神经节神经元的中枢突数量增加了100倍。此外, 1-2周前发生的周围神经损伤会导致中枢支在脊髓背柱损伤部位的内外再生。因此,神经生长能力的增强是条件性损伤诱导的神经元反应的结果,与神经细胞体中的转录激活相关。信号转导是当前神经损伤后轴突再生研究的热点领域。信号转导和转录激活蛋白STAT3被许多细胞因子和生长因子激活而介导多种生理过程。STAT3蛋白含有DNA结合域,SH2区和转录激活区等保守区域,通过705位酪氨酸的磷酸化而激活,形成二聚体,入核与特异DNA元件结合,启动靶基因的转录。STAT3在神经系统的发育过程中有表达,并与其他信号途径协同调节体内神经前体细胞的分化命运,STAT3结合元件的甲基化状态还决定了细胞的分化潜能。STAT3蛋白还参与维持神经细胞的存活和促进神经损伤后的再生。已证明JAK/STAT信号转导是在外周神经细胞轴索切断后被激活的,并且它对神经再生和神经元存活是至关重要的。在外周神经横断后,新生运动神经元中STAT3蛋白表达显著增加并可以被Tyr705磷酸化而激活。坐骨神经损伤后的STAT3磷酸化能被持续从神经束膜注入至最近神经残端的JAK2抑制物AG490所阻断。在体外,神经束膜注入的AG490能阻碍神经轴突的增生,在条件损伤坐骨神经后,AG490也能显著降低成熟的成人脊髓中神经元轴突再生。由此推断:条件损伤后,STAT3的活化作用对提高伤后DRG感觉神经元生长能力是至关重要的。细胞因子信号转导抑制因子（ suppressor s of cytokine signaling, SOCS）是可以抑制JA K/ STA T信号通路的负调控因子。1997年以来,相继发现SOCS家族的CIS和SOCS1～7共8个成员,其中SOCS3 （ suppressor of cytokine signaling 3）可与细胞因子受体相结合,使其在空间结构上与JA Ks紧密相邻,同时结合并抑制JA Ks激酶的活性,以抑制STA T3的磷酸化。大鼠周围神经损伤后,在其背根神经节中检测的SOCS3 mRNA表明了一个明显的抑制作用。病毒载体是目前基因研究和治疗中多采用的目的基因的转移工具,腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒及慢病毒等病毒载体系统是应用的比较多的。本研究使用的是慢病毒载体。慢病毒为非致癌性病毒,能感染多种脏器,其特点为持续时间长、潜伏期长的慢性感染,属逆转录病毒家族。慢病毒的特点是在包膜基因和逆转录酶基因之间以及3’端包膜蛋白基因区含有开放性读码框,目前由人类免疫缺陷Ⅰ型病毒演变而来慢病毒是最常用的。为增加其安全性,以删除vpr、vpu、nef、vif基因的质粒包装慢病毒载体。构建慢病毒载体时,在3’长末端重复系列的U3区,通过删除133bp碱基以达到病毒载体的自身灭活,而5’长末端重复系列的U3区以巨细胞病毒（CMV）启动子取代。慢病毒能携带9kb容量的外源基因,对神经元具有高度亲嗜性,不具有逆向转运的能力,作为表达载体在中枢系统研究中应用非常理想。此项研究的目的是构建携带信号转导和转录激活蛋白STAT3和基因突变的雌激素受体ER的慢病毒载体,并转染受损的大鼠背根神经节神经元,研究其对神经元突起再生的作用;通过慢病毒转导SOCS3和作用相反的突变的SOCS3（m SOCS3）,体外研究SOCS3在成年鼠的初级感觉神经元再生中的作用;探讨STAT3和SOCS3在神经元轴突再生中的相互作用及关联性。本实验运用基因重组技术,将STAT3、ER和核糖体介导的绿色荧光蛋白（IRES-GFP）片段插入慢病毒载体pRRL-MCS+的PmeI位点构建慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP,经RT-PCR、western blotting和测序分析加以鉴定其正确性。将慢病毒载体质粒pRRL-SOCS3-IRES-GFP,pRRL-mSOCS3-IRES-GFP和pRRL-STAT3ER-IRES-GFP分别转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。切断大鼠左L5近神经节的神经根,摘取L5背根神经节做分离神经元培养,阳性对照的大鼠,在捣碎背根前立即在髋部横断左侧坐骨神经（SN）。分别将三种慢病毒载体感染神经元细胞,采用免疫荧光染色法观察神经元细胞核质反应和突起的长度,通过实时PCR和原位杂交检测DRG s中SOCS3mRNA的存在。实验结果是构建的慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP经RT-PCR和western blotting鉴定正确;测序分析与Genbank报道的STAT3基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,测定慢病毒滴度为1010-11 TU/ml。转染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神经元经4 -羟基三苯氧胺（4HT）激活,STAT3ER有明显的核转运,并增强突起的生长,经χ2检验与对照组有显著性差异。在神经损伤后SOCS3 mRNA的浓度在背根神经节神经元中明显增加,外源性SOCS3能阻止神经元中STAT3的磷酸化及核移位,mSOCS3增强了突起生长。实验结论:1.成功构建了表达小鼠STAT3ER基因的慢病毒载体。2.证实了STAT3信号转导有利于轴突生长。3. SOCS3通过抑制STAT3和/或其他转导因子抑制轴突生长。

论文目录

• 一、摘要
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、正文
• （一） 前言
• （二） 第一部分 慢病毒载体的构建及病毒包装和滴度测定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• （三） 第二部分 STAT3 体外对神经元再生作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• （四） 第三部分 SOCS3 对大鼠初级感觉神经元生长作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 四、附录
• 五、致谢