7，12-二甲基苯蒽（DMBA）体外诱导山羊乳腺上皮细胞的转化

论文摘要

本试验对山羊乳腺组织细胞的分离及原代培养方法进行了改进,并对乳腺上皮细胞的一些生长特性作了总结;在此基础上,以7,12-二甲基苯蒽（DMBA）为致癌剂,佛波酯（TPA）为促癌剂,探索了乳腺上皮细胞体外两步法转化的过程,摸索了改良Feulgen染色的程序,为进一步利用ICM（显微图像分析仪）对转化过程中核DNA 含量的变化进行实时监测奠定基础,结果如下: 1. 用组织块培养法和消化法均可获得良好的山羊乳腺细胞原代培养物;培养的山羊乳腺成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感,混合培养物用0.15%胰蛋白酶与0.02% EDTA 消化液在37℃控时消化,先脱落下来的主要为成纤维细胞,经过23 代传代筛选培养,即可得到纯化的乳腺上皮细胞。2. 用添加10% DMSO 和10%胎牛血清的DMEM/F12 为冻存液,按直径不同将山羊乳腺组织块分成3 组:小于0.3 mm,0.30.5 mm 和0.51.0 mm,并适当延长体外平衡时间进行冷冻保存。结果表明:以直径<0.3 mm,每管不超过6 块为佳,采用室温平衡6　h 后分两次梯度添加DMSO 至10%,于0 ℃平衡1 h,-20 ℃平衡2 h,直接投入到液氮中的冻存效果较好。3. 用DMEM/F12 体外培养山羊乳腺上皮细胞,传至第9 代时其生长仍正常。多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对细胞上清液中的蛋白质进行分离,其中有3 个条带与标准蛋白的3个条带一致,表明山羊乳腺上皮细胞在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。4. 以含5　ug/mL、10　ug/mL、15　ug/mL DMBA 的完全培养液对组织块和消化法得到的细胞分别进行36 h,24 h和12 h处理后,施以25 ng/mL　TPA作用2 周,结果显示,15　ug/mL　DMBA 作用12 h组细胞基本死亡,5　ug/mL DMBA 36 h组细胞转化效果最佳;转化细胞的初期形态学表现为:细胞增大,扁平;随后细胞核浓缩,细胞整体变小;接着细胞排列紊乱,出现无规则生长;最后出现转化灶。5. 应用改良Feulgen染色法定量监测转化过程中细胞核DNA 的变化,以95%乙醇固定15 min,8mol/mL 盐酸水解10 min,Schiff 液作用20 min,其染色效果较佳;对培养在塑料皿中的单层细胞直接染色时,最后的二甲苯透明和树胶封片两步要删除,以免影响最终的染色效果。

论文目录

• 第一部分 文献综述
• 第一章 动物乳腺细胞培养及体外化学物致癌的研究进展
• 1.1 动物细胞培养研究进展
• 1.1.1 动物细胞培养的发展简史
• 1.1.2 细胞系的生长特点
• 1.1.3 细胞增殖周期
• 1.2 乳腺细胞体外培养的研究进展
• 1.2.1 乳房的结构
• 1.2.2 乳腺细胞培养研究概况
• 1.2.3 培养方法的研究
• 1.2.4 乳腺上皮细胞的类型及其相关性
• 1.2.5 建立乳腺细胞系的研究
• 1.3 体外化学物的研究现状
• 1.3.1 化学致癌物
• 1.3.2 化学物致癌的机理
• 1.4 癌发生过程的研究
• 1.4.1 体内癌的形成
• 1.4.2 体外模拟细胞癌变的过程
• 1.4.3 结语
• 第二部分 实验研究
• 第二章 山羊乳腺上皮细胞的分离和培养
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 原代培养
• 2.2.2 山羊乳腺上皮细胞传代及其纯化培养
• 2.2.3 山羊乳腺组织块冷冻保存
• 2.2.4 山羊乳腺上皮细胞表达蛋白的检测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 原代培养方法及酶的选择
• 2.3.2 细胞系的纯化
• 2.3.3 乳腺组织块体外冷冻保存
• 2.3.4 乳腺上皮细胞的分泌功能
• 2.4 小结
• 第三章 山羊乳腺上皮细胞体外转化的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 转化细胞的形态学观察
• 3.2.2 DMBA 的浓度对消化法细胞存活的影响
• 3.2.3 DMSO对细胞生长的影响
• 3.2.4 DMBA 的浓度对组织块培养法转化过程的影响
• 3.2.5 核DNA 染色定量技术
• 3.3 讨论
• 3.3.1 致癌物浓度与转化效率
• 3.3.2 DMSO的细胞毒作用
• 3.3.3 改良Feulgen染色过程中的注意事项
• 3.3.4 细胞核DNA含量测定与体外转化相关性分析
• 3.4 小结
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介