论文摘要
目的WT1（Wilms Tumor suppressor-1）基因在各类白血病中异常高度表达,而且过度表达的WT1基因与正常细胞恶性转化有关。本实验拟通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,以WT1基因为靶点,构建编码人WT1基因的shRNA（short hairpin RNA）真核质粒表达载体,转染人白血病细胞K562,首先,观察其对K562细胞WT1基因mRNA及蛋白表达的抑制作用;其次,观察下调WT1基因表达对K562细胞形态、生长状况、细胞周期、增殖、凋亡及细胞分化等生物学行为的影响;再次,探讨下调WT1基因表达对K562细胞基因表达谱的影响,为进一步研究WT1基因在白血病的生物学功能及白血病的基因治疗奠定基础。除此之外,我们还将探讨WT1 shRNA对耐药细胞株K562/AO2对阿霉素药物敏感性的影响,揭示下调WT1基因表达逆转K562/AO2细胞阿霉素耐药的可能作用。方法1.构建编码人WT1基因shRNA质粒表达载体根据siRNA设计原则,设计合成WT1shRNA及无任何干扰效果的阴性shRNA的DNA模板单链,在两端加入限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点,退火形成双链,质粒P Genesil-1的BamHⅠ+HindⅢ双酶切线性化,稀释退火片段与线性化PGenesil-1质粒表达载体经T4DNA连接酶连接,酶切、测序鉴定。构建的三个重组质粒分别命名为pWT1-shRNA1和pWT1-shRNA2,pNeg。2.pWT1-shRNA转染K562细胞条件的优化不同比例质粒pWT1-shRNA和转染试剂Superfect的复合物,不同时间,转染K562细胞,因质粒中含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因,转染后可用荧光显微镜和流式细胞仪FITC的常规检测方法检测转染效率,根据转染效率,优化转染条件。3.pWT1-shRNA抑制K562细胞WT1基因表达的研究用最佳配比的质粒pWT1-shRNA1（或pWT1-shRNA2）和转染试剂Superfect的复合物转染K562细胞,分别于转染前及转染后48h,经流式细胞仪分选转染成功的细胞,实时荧光定量RT-PCR检测WT1mRNA表达水平,Western blot法检测WT1相应功能蛋白的表达水平。同时设立未转染组、空质粒组（pCon）、阴性质粒（pNeg）组作为对照。4.下调WT1基因对K562细胞生物行为的影响pWT1-shRNA转染K562细胞后,倒置显微镜观察细胞生长状态,绘制细胞生长曲线;细胞涂片,Wright-Giemsa染色,观察细胞形态学改变;MTT检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪Annexin-V/PI试剂盒及DNA梯状条带电泳检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞周期的变化;转染后的细胞经TPA诱导,NBT还原试验及流式细胞分析细胞分化抗原CD9、CD14判断pWT1-shRNA对TPA诱导K562细胞分化的影响,同时设立同时设立未转染组、空质粒组（pCon）、阴性质粒（pNeg）组作为对照。5.下调WT1基因表达K562/AO2细胞对阿霉素敏感性的影响pWT1shRNA1转染K562/AO2细胞48h,流式细胞术（FCM）检测转染效率,经阿霉素作用后,MTT检测细胞阿霉素IC50的变化;FCM检测细胞阿霉素累积量,及细胞凋亡的变化,同时设立未转染组、空质粒组（pCon）、阴性质粒（pNeg）组作为对照。6.下调WT1基因表达对K562细胞基因表达谱的影响转染组流式细胞分选EGFP阳性的细胞,纯化后,逆转录为cDNA,转染组与对照组分别用cy3、cy5标记,与22K human genome array基因芯片杂交,经LuxScan 10KA双通道激光扫描仪扫描,LuxScan 3.0图像分析软件分析,观察杂交效果;聚类分析评价三次实验的一致性;所得信息进行差异表达基因的筛选,并进一步行pathway及GO基因功能分类等生物信息学分析。选择分析结果中上调和下调基因各一个,进行荧光定量RT-PCR验证。本部分为三次生物学重复结果1.构建编码人WT1基因shRNA质粒表达载体经酶切、测序鉴定pWT1shRNA1,pWT1shRNA2,pNeg构建成功。2.转染条件的优化不同比例质粒与转染试剂复合物转染K562（2×106/ml）细胞,当质粒DNA为1.5μg,DNA∶SF为1∶4,转染48h,转染效率达到峰值（65.34±5.64）%,与对照组相比差异具有显著性（p＜0.05）。3.pWT1shRNA对K562细胞WT1基因表达的抑制作用转染48h流式细胞仪分选EGFP阳性的细胞,纯度可达98.0%±1.2%,荧光定量RT-PCR及Western-blot结果显示:pWT1-shRNA1组及pWT1-shRNA2组WT1基因mRNA及蛋白的表达较转染前,及各对照组转染明显降低,差异具有显著性（p＜0.05）,pWT1-shRNA1组（mRNA抑制效率86.4%±5.2%,蛋白抑制效率85.1%±9.1%）较pWT1-shRNA2组（mRNA抑制效率为53.6%±3.7%,蛋白抑制效率为52.4%±4.9%）抑制作用更强（p＜0.05）;与未转染组相比,pNeg组及pCon组WT1mRNA及蛋白表达水平无显著性差异p＞0.05)。4.WT1基因表达下调对K562生物学行为的影响4.1 WT1基因表达下调对K562形态学的影响倒置显微镜下pWT1-shRNA1组细胞形态多变,胞体畸形,核形凹陷,细胞死亡增多;Wreigt-Gimsa染色结果显示:未转染组细胞大小均匀,核大而明显,呈蓝色,核仁清楚,核浆比例大;pWT1-shRNA1组细胞体积大小不一,有的细胞可见核固缩、碎裂,胞浆中可见大量空泡,细胞膜不完整、甚至细胞崩解。4.2下调WT1基因表达对K562细胞增殖的影响4.2.1生长曲线pWT1-shRNA1组细胞生长缓慢,pNeg组及pCon组与未转染组相比,无差异。4.2.2 MTT检测细胞增殖抑制率结果显示:pWT1-shRNA1组细胞在各个时间点抑制率均明显高于其他各组（p＜0.05）,而pNeg组及pCon组与未转染相比,各时间点均无显著性差异（p＞0.05）。4.3下调WT1基因表达对K562细胞凋亡的影响4.2.1流式细胞仪Annexin V/PI分析结果转染48小时,经流式细胞对EGFP阳性的细胞采用AnnexinV/PI双参数法进行细胞凋亡分析,结果显示:pWT1-shRNA1组细胞凋亡率（33.2%±3.1%）高于其他各对照组（p＜0.05）;而pNeg组、pCon组与未转染组相比,无显著性差异（p＞0.05）。4.2.2细胞凋亡DNA条带电泳结果转染72h的细胞,经流式细胞分选获得EGFP阳性的细胞至少1×106,行细胞凋亡DNA条带检测,结果显示:pWT1-shRNA1组出现DNA梯状条带,而其它各组均未出现。4.3下调WT1基因表达对K562细胞周期分布的影响转染48h,经流式细胞仪分选获得EGFP阳性的细胞,FCM分析细胞周期。结果显示:与各对照组相比,pWT1-shRNA1组G2/M期细胞比例上升（P＜0.05）,G1/G0和S期的细胞比例下降（P＜0.05）,出现G2/M期阻滞。4.4下调WT1基因表达对K562细胞分化的影响4.4.1 NBT还原试验结果与未转染组相比,各转染组NBT还原率无统计学差异（p＞0.05）,TPA作用后,各组细胞NBT还原率较未加药组逐渐升高,差异具有显著性（p＜0.05）,pWT1-shRNA1+TPA组细胞NBT还原率各个时间点均高于其他各组（p＜0.05）。4.4.2流式细胞检测细胞分化抗原结果FCM检测巨核细胞分化标志CD9和单核细胞分化标志CD14结果显示:与未转染组相比,各转染组CD9、CD14的阳性率无统计学差异（p＞0.05）,TPA作用后,随着时间的延长,各组细胞CD9的阳性率较未加药组逐渐升高,差异具有显著性（p＜0.05）,而CD14的阳性率无此变化趋势（p＞0.05）,pWT1-shRNA1+TPA组细胞CD9阳性率各个时间点均高于其他各组（p＜0.05）,而CD14的阳性率无明显改变（p＞0.05）。5.下调WT1基因表达对K562/AO2细胞阿霉素敏感性的影响转染pWT1-shRNA后,经阿霉素诱导24小时,MTT结果显示:WT1shRNA组K562/AO2细胞对阿霉素的敏感性增高,相对逆转率为67.3%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高（p＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（p＜0.05）。6.芯片分析结果6.1芯片杂交效果总体评价芯片有效检测率正常,经散点图和Cluster聚类分析,三张芯片重复性较好。6.2差异性表达基因筛选经三张生物学重复芯片杂交数据进行T-test检验,结合p＜0.05,Ratio＞2或＜0.5的标准,筛选差异表达基因,结果显示:差异表达基因共315个,其中上调102个（32.38%）,下调213个（67.62%）。6.3 MAS系统Pathway分析结果结果显示这些差异表达基因共影响了34条通路（p＜0.05）,主要包括翻译、转录、细胞增殖、细胞周期、凋亡、信号转导、细胞代谢等。6.4 MAS系统GO分析结果结果显示:差异表达基因的分子功能以生理过程,细胞进程为主。23个凋亡相关基因差异表达,差异表达基因中抗凋亡基因和凋亡负调控基因多数下调,凋亡诱导基因和凋亡基因多数上调,13个细胞增殖相关基因差异表达,差异表达基因中细胞增殖负调控基因多数上调,细胞增殖基因和细胞增殖正调控基因多数上调,20个调控细胞周期的基因差异表达共,表达上调基因包括部分G2M期相关及细胞周期负性调控基因,表达下调的基因以G0期及S期相关基因为主。6.5荧光定量RT-PCR验证结果检测上调基因PDCD4、下调基因VEGF,显示与芯片检测结果相符合。结论1成功构建了以人WT1基因为靶位的真核表达质粒载体pWT1-shRNA。2经过优化转染条件,高分子树脂转染试剂Superfect可以将重组pWT1-shRNA高效转染入人白血病细胞系K562。3真核表达载体pWT1-shRNA转染入K562细胞后可以有效地实现对靶基因mRNA的降解,进而抑制相应蛋白的表达。4下调K562细胞WT1基因表达,K562细胞增殖受抑制、凋亡率增高、G2/M期阻滞,可以促进TPA诱导的细胞先向巨核系分化。5下调K562细胞WT1基因表达可增强K562/AO2细胞对阿霉素的敏感性,逆转阿霉素耐药,诱导细胞凋亡。6下调WT1基因表达可以引起K562细胞基因表达谱改变,影响细胞凋亡、增殖、细胞周期、信号转导等通路,VEGF可能是WT1基因直接的下游靶基因。
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