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湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究

2020-11-28阅读(306)

湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究

论文摘要

湿地松、火炬松自上世纪30年代引种至今,两树种已成为我国南方地区大面积造林的主要经济树种。然而,其相对滞后的良种繁育技术仍然制约着两个树种的发展。本研究以湿地松、火炬松不同组织器官为材料,对其直接器官发生、间接器官发生、直接体胚发生等离体培养快繁技术进行系统研究,以建立高效、稳定的湿地松、火炬松离体培养植株再生体系,为其它针叶树种的组培快繁技术提供借鉴。研究的主要内容及结果以下:一.湿地松直接器官发生与植株再生技术以湿地松（Pinus elliottii Engelm）抗病家系和非抗病家系的成熟合子胚为外植体,以不同基本培养基、激素种类及浓度配比和不同的培养方式,研究湿地松离体培养继代增殖的关键技术及主要影响因子。研究结果表明湿地松家系或基因型、继代代数及激素种类浓度的配比是湿地松组培继代增殖效率的主要影响因子。湿地松组培快繁的最佳增殖培养基为B5+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L,年增殖率可达3.696.2。利用家系间或家系内个体间增殖率的显著差异,筛选了适宜组培快繁的普通家系优良基因型132个、抗病家系优良基因型2个。通过固体培养与添加液体营养液的双层培养基的培养方式解决了湿地松继代增殖率与有效芽苗率的消长问题,有效缩短了继代周期,简化了培养程序。生根培养阶段,通过对培养基大量元素浓度水平的对比试验,结果表明生根培养初期以无大量元素培养基诱导生根,25d后添加大量元素的培养程序可有效缩短生根培养时间,提高生根率,达到理想的生根效果。本研究基本解决了湿地松长期继代增殖及生根技术问题,建立了稳定的离体快繁增殖及生根体系。但该培养技术的产业化应用还需进一步的中试及相关操作工艺设备的改进,以降低组培苗的生产成本。二、湿地松间接器官发生与植株再生技术以湿地松成熟合子胚、胚苗顶芽、下胚轴、胚根为外植体,选用低盐量的DCR、LP、TX 3种基本培养基,与不同浓度NAA、2,4-D及不同浓度6-BA组合,研究湿地松器官性愈伤组织诱导、增殖及器官分化培养阶段的关键技术。试验结果表明:成熟合子胚、胚苗顶芽是诱导器官性愈伤组织理想的外植体,诱导器官性愈伤组织的最佳培养基为TX+BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+30 g/L蔗糖,诱导率高达50%以上;增殖培养基为TX+BA 0.3 mg/L+NAA 1.0 mg/L+CH 400 mg/L+30 g/L蔗糖,继代周期25～30d,增殖率达3.46;器官分化培养基为TX+BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖,每块愈伤组织可分化20个以上不定芽;不定芽的同步化发育培养基为TX+BA 0～0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖;NAA是器官性愈伤组织诱导、增殖必不可少的生长素。湿地松间接器官发生程序复杂,但其增殖效率远远高于直接器官发生效率。组织细胞学研究结果表明:亮白色、半紧实结构的外部形态及大量“拟分生组织”的内部结构的形成是器官性愈伤组织的重要标志。不定芽原基的分化发育过程约为40～45d。三、湿地松体细胞胚胎发生以湿地松成熟合子胚及未成熟合子胚为外植体,对影响湿地松体胚诱导、ESM维持与增殖培养及体胚成熟等关键技术环节的主要因素进行系统研究。研究结果表明:多胚特征的合子胚发育阶段是湿地松体胚诱导最理想的外植体,即发育第2、3、4阶段的合子胚。基本培养基、激素种类浓度组合及两因素的交互作用对ESM诱导率及外植体褐化率均有极显著影响,湿地松体胚发生最佳培养基激素组合为LP+ 2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L和DCR+ NAA2.0 mg/L +6-BA0.63 mg/L+KT0.61mg/L,4个家系在两种培养基ESM平均诱导率分别为24%和22.75%。球果短时间冷藏处理、雌配子体“倾斜接种”方式以及在培养基添加乙烯抑制剂及pH缓冲液均有利于提高湿地松体胚诱导率,采用国产琼脂代替进口Phytagel作为植物凝胶剂可起到同样的诱导效果。ESM维持培养阶段,胚性组织胚性的失去或因生长势的衰弱而死亡是针叶树种体胚发生的普遍现象。通过对培养基与激素组合的优化获得了4个可长期快速增殖的胚性细胞系,DCR+NAA 1.0 mg/L +6-BA 0.32 mg/L + KT 0.30 mg/L为湿地松ESM的最佳增殖培养基。生长素是维持胚性的极性结构所必需的,但高浓度的生长素对体胚的生长、发育成熟不利,尤其是高浓度2,4-D可能导致体胚的畸形。添加AC的无激素预培养是体胚发育成熟的必要条件。ABA是体胚从增殖到成熟转化的关键因素。外源ABA与PEG和高浓度蔗糖的组合进一步促进了体胚的发育成熟,湿地松体胚在成熟培养基PL+ABA 50 mg/L+PEG6000 20%+6%蔗糖上获得了发育5阶段的子叶胚。四、火炬松体细胞胚胎发生以火炬松优良家系20-692、20-615、20-1036、20-639不同球果采收期合子胚为外植体,选用4种针叶树体胚发生专利培养基AL、TX、LP、DS分别与AL、TX、LP培养基激素组合及无激素组合形成16种体胚诱导培养基,开展火炬松体胚诱导试验。研究结果表明:体胚诱导最理想的外植体为第2、3、4发育阶段合子胚。外植体基因型是影响体胚诱导率的关键因素,通过培养基、激素组合及其它培养条件的优化是打破离体培养顽拗型基因型限制的有效措施。LP+2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L、AL+2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L培养基可获得较高的体胚诱导率,且体胚质量高。不同的胚性细胞系对体胚成熟培养反应不同,只有具有完整体胚的培养物转入成熟培养基,体胚才能进一步的发育成熟。火炬松胚性细胞系AL-225经无激素培养基预培养后转入AL+ABA 50 mg/L+15%PEG8000的成熟培养基,体胚得以进一步的发育,但未能获得完全成熟体胚。以火炬松成熟合子胚为外植体获得了可持续增殖的ESM。但成熟合子胚体胚诱导率仅为3%,远远低于非成熟合子胚诱导率。但成熟合子胚体胚发生技术仍具有重要的研究价值。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一章 针叶树离体培养及植株再生研究进展
  • 1. 针叶树种离体培养与植株再生方式及其特性
  • 1.1 直接器官发生
  • 1.2 间接器官发生
  • 1.3 直接体胚发生
  • 2. 针叶树种器官发生研究进展及其影响因素
  • 2.1 直接器官发生植株再生研究进展
  • 2.2 间接器官发生植株再生研究进展
  • 2.3 针叶树器官发生的影响因素
  • 2.3.1 外植体基因型与器官发生
  • 2.3.2 外植体生理状态与器官发生
  • 2.3.3 培养基类型与器官发生
  • 2.3.4 植物激素种类浓度组合与器官发生
  • 2.3.5 光照调控与器官发生
  • 3. 针叶树种体胚发生研究进展及影响因素
  • 3.1 体胚发生与植株再生研究进展
  • 3.2 针叶树体胚发生的步骤及影响因素
  • 4. 结语
  • 第二章 湿地松、火炬松离体培养植株再生研究进展
  • 1. 湿地松、火炬松离体培养与植株再生研究进展
  • 1.1 直接器官发生植株再生研究进展
  • 1.2 间接器官发生植株再生研究进展
  • 1.3 湿地松、火炬松体胚发生植株再生研究进展
  • 2. 针叶树种组培快繁技术研究中存在的技术问题
  • 2.1 器官发生与植株再生研究存在的问题
  • 2.2 体细胞胚胎发生研究存在的问题
  • 3. 结语
  • 第三章 湿地松直接器官发生继代增殖的影响因子
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 无菌培养物的建立
  • 1.3 抗病家系与非抗病家系对继代增殖的影响
  • 1.4 继代增殖与增殖代数的相关性试验
  • 1.5 6-BA 与 NAA 对继代增殖的影响
  • 1.6 培养条件
  • 1.7 数据统计与分析方法
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 胚离体培养及胚苗萌发结果
  • 2.2 丛生芽分化结果与分析
  • 2.2.1 丛生芽分化基本培养的筛选
  • 2.2.2 不同家系丛生芽分化结果与分析
  • 2.3 继代培养芽增殖率与增殖代数的相关性试验结果与分析
  • 2.4 6-BA 与 NAA 的负互作效应对组培快繁效率的影响结果
  • 3. 结语
  • 第四章 湿地松直接器官发生优良基因型的筛选
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 初代培养基的设计
  • 1.3 优良基因型的筛选标准
  • 1.4 继代增殖培养基的设计与优化
  • 1.5 生根培养程序的优化
  • 1.6 移栽管理技术措施
  • 1.7 培养条件
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 初代培养基的筛选与优化
  • 2.2 优良基因型的筛选结果
  • 2.3 增殖效率（年增殖率）与继代培养基的关系
  • 2.4 芽苗的生根诱导试验结果与分析
  • 2.5 组培苗的移栽
  • 3. 结论
  • 第五章 湿地松间接器官发生器官性愈伤组织诱导与增殖
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 种子的无菌处理
  • 1.3 愈伤组织诱导培养基设计
  • 1.3.1 基本培养基与激素组合的筛选
  • 1.3.2 生长素种类的筛选
  • 1.4 愈伤组织的增殖培养基设计
  • 1.5 不同浓度 CH 对愈伤组织增殖的影响
  • 1.6 抗氧化剂在增殖培养基中的应用
  • 1.7 暗培养对外植体褐化的影响
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 合子胚器官性愈伤组织诱导结果与分析
  • 2.2 胚苗顶芽、下胚轴、胚根器官性愈伤组织诱导结果与分析
  • 2.3 生长素种类浓度对合子胚器官性愈伤组织诱导的影响
  • 2.4 激素组合对器官性愈伤组织的增殖的影响
  • 2.5 水解酪蛋白对器官性愈伤组织增殖速率的影响
  • 2.6 PVP 与 Ac 对愈伤组织褐化的影响
  • 2.7 暗培养对外植体褐化的影响
  • 3. 结语与讨论
  • 第六章 湿地松器官性愈伤组织不定芽分化、植株再生与组织细胞学观察
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 愈伤组织器官分化培养基的筛选
  • 1.2.1 激素组合的筛选
  • 1.2.2 水解酪蛋白、蔗糖、活性炭对不定芽分化的影响
  • 1.3 不定芽分化的组织细胞学观察
  • 1.4 芽器官发育的同步化
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 愈伤组织不定芽的分化结果
  • 2.1.1 激素组合对不定芽分化的影响
  • 2.1.2 水解酪蛋白对不定芽分化的影响
  • 2.1.3 蔗糖浓度对不定芽分化的影响
  • 2.1.4 活性炭对不定芽分化的影响
  • 2.2 不定芽器官分化的组织学观察结果与分析
  • 2.3 不定芽的同步化生长发育
  • 3. 结语与讨论
  • 第七章 湿地松体细胞胚胎发生--ESM 的诱导
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.1.1 试验材料1
  • 1.1.2 试验材料2
  • 1.2 未成熟合子胚发育阶段的检测方法
  • 1.3 诱导培养基的设计
  • 1.3.1 成熟种胚外植体诱导培养基
  • 1.3.2 未成熟合子胚外植体诱导培养基
  • 1.4 其它因素对 ESM 诱导率影响
  • 1.5 外植体的无菌处理及半固体培养基的制备
  • 1.5.1 成熟种胚的无菌处理
  • 1.5.2 未成熟球果的无菌处理
  • 1.6 数据统计与分析
  • 1.7 培养条件
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 成熟合子胚胚性培养物诱导试验结果与分析
  • 2.2 湿地松不同家系未成熟球果合子胚发育进程
  • 2.2.1 湿地松合子胚发育过程
  • 2.2.2 不同家系合子胚发育进度差异
  • 2.3 球果采收期（合子胚发育阶段）对 ESM 诱导的影响
  • 2.3.1 湿地松 ESM 的诱导过程
  • 2.3.2 合子胚发育阶段与 ESM 活力的关系
  • 2.3.3 合子胚发育阶段与 ESM 诱导率的关系
  • 2.4 培养基、激素组合对 ESM 诱导率的影响
  • 2.4.1 不同培养基激素组合雌配子体的形态反应与分析
  • 2.4.2 不同培养基激素组合对 ESM 诱导率、褐化率的影响
  • 2.5 外植体的接种方式对 ESM 诱导率的影响与分析
  • 2.6 球果冷藏时间对 ESM 诱导率的影响与分析
  • 2.7 植物凝胶种类浓度对 ESM 诱导率的影响
  • 2.8 硝酸银与 MES（pH 缓冲液）对 ESM 诱导率的影响
  • 3. 结语与讨论
  • 第八章 湿地松 ESM 的维持、增殖与体胚的成熟
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 ESM 的维持、增殖培养基
  • 1.3 增殖培养方法
  • 1.4 体胚发育、成熟培养方法
  • 1.5 体胚的发育与成熟培养基
  • 1.6 ESM 增殖与体胚成熟的培养条件
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 ESM 胚性维持培养结果与分析
  • 2.2 胚性细胞系的增殖培养基的优化与筛选
  • 2.2.1 增殖培养基的筛选
  • 2.2.2 胚性细胞系增殖的组织细胞学观察
  • 2.3 体胚的发育与成熟培养结果
  • 3. 结语与讨论
  • 第九章 火炬松未成熟合子胚体细胞胚胎发生
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 合子胚发育阶段的检测
  • 1.3 4 种专利培养基与诱导培养基的设计
  • 1.4 不同浓度生长素2,4-D 对体胚诱导的比较试验
  • 1.5 半固体培养基的准备、外植体的无菌消毒及培养条件
  • 1.6 ESM 的维持与增殖培养
  • 1.7 体胚的成熟
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 合子胚发育阶段镜检结果
  • 2.2 雌配子体在不同培养基上的形态反应
  • 2.3 ESM 诱导率与合子胚发育的相关性
  • 2.4 不同家系不同培养基的 ESM 诱导率、褐化率及其方差分析
  • 2.5 生长素2,4-D 浓度对体胚诱导率的影响
  • 2.6 ESM 维持与增殖培养结果与分析
  • 2.7 体胚成熟培养结果与分析
  • 3. 结语与讨论
  • 第十章 火炬松成熟合子胚体细胞胚胎发生
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 材料来源
  • 1.2 外植体无菌消毒程序
  • 1.3 诱导培养基与体胚诱导率
  • 1.4 种子重量与体胚诱导率的关系
  • 1.5 合子胚接种方式
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 不同培养基激素组合对成熟合子胚体胚诱导的影响
  • 2.2 种子重量与体胚诱导的关系
  • 2.3 接种方式及种子提取液对体胚诱导率的影响
  • 3. 结语与讨论
  • 第十一章 结语与展望
  • 1. 湿地松、火炬松离体培养植株再生技术研究的主要结论
  • 2. 湿地松、火炬松离体培养快繁技术研究存在的问题
  • 3.松属树种离体培养快繁技术产业化应用前景与展望
  • 参考文献
  • 附录 攻读博士学位期间已发表的论文

    • 相关论文文献

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