黑胸大蠊浓核病毒含磷脂酶A2功能区在大肠杆菌中的表达及活性研究

论文摘要

黑胸大蠊是在我国城乡室内分布的主要蟑螂种类,黑胸大蠊浓核病毒（Periplaneta fuliginosa Densovirus, PfDNV）是国内外第一个分类鉴定的蟑螂浓核病毒。其病毒理化性质、基因组结构分析,与组织病理学方面的研究均已完成。但长期以来,由于缺乏稳定的PfDNV体外感染的细胞模型,PfDNV结构蛋白的功能及其复制侵染的分子机理仍不清楚。研究发现,细小病毒的结构蛋白中具有磷脂酶A2（PLA2）基序与分泌型磷脂酶（如:蛇毒和蜂毒等）的基序有较高的同源性,包含保守的钙离子结合位点YXGXG和催化活性位点HDXXY。插入缺失突变表明,该功能域在病毒粒子的侵染过程中发挥调控作用。据此,为了进一步研究黑胸大蠊浓核病毒中磷脂酶A2功能域的功能,我们通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得PfDNV含磷脂酶A2（PLA2）功能域片断,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus（DE3）-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,pET28a-PLA在一般条件下诱导获得包涵体,pET26b-PLA通过优化表达条件在细胞质和周质空间里获得了重组蛋白的可溶性表达形式,以Ni-NTA亲和层析柱在非变性条件下纯化了目的蛋白,以卵磷脂为底物测定其磷脂酶A2活性,对结果进行初步比较分析,结果成功表达PfDNV重组蛋白PLA2,这些初始工作为下一步抗血清的制备研究PfDNV磷脂酶A2功能域在病毒粒子中的存在形式和通过定点突变等方法对其生物学特性的深入研究奠定了基础。

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前言

一.细小病毒的特征概述

二.浓核病毒的分类现状

三.黑胸大蠊浓核病毒的发现

四.黑胸大蠊浓核病毒的基因组结构

五.黑胸大蠊浓核病毒中的磷脂酶A2功能域

六.磷脂酶A2的基本性质

七.磷脂酶A2结构特征

八.磷脂酶A2的催化机

九.磷脂酶A2的生理功能

十.磷脂酶A2的应用

十一.本研究的目的与意义

材料和方法

一.材料

1.1 菌株和质粒

1.2 工具酶和试剂盒

1.3 PCR产物的回收，连接，鉴定所用的试剂溶液

1.4 细菌培养所用溶液

1.5 蛋白表达所用的试剂溶液

1.6 蛋白纯化相关溶液

1.7 WESTERN所用溶液

二.方法

2.1 引物设计及PCR扩增

2.2 PCR产物的回收和T载体连接

2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.4 转化

2.5 质粒的小量制备

2.6 重组质粒的鉴定

2.7 重组原核表达载体的构建

2.8 菌种的甘油保存

2.9 序列测定

2.10 重组蛋白的诱导表达

2.11 重组蛋白的亚细胞组分分析

2+柱亲和层析法纯化蛋白'>2.12 Ni²⁺柱亲和层析法纯化蛋白

2.13 Western Blot免疫印迹

2.14 蛋白质浓度测定

2.15 磷脂酶A2活性的测定

结果

一.PCR产物

二.重组T载体的鉴定

三.重组表达质粒的鉴定

四.pET28a-PLA2融合蛋白的表达和纯化

五.pET26b-PLA2融合蛋白的表达和鉴定

六.可溶性目的蛋白的定量和活性分析

七.PfDNV PLA2功能域的多重序列比对和进化树分析

讨论

一.细小病毒中的磷脂酶A2

二.关于大肠杆菌表达载体的探讨

三.稀有密码子及解决策略

四.关于可溶性表达的策略的探讨

五.本研究的实验小结

参考文献

附录

研究生在读期间发表与待发表的文章

致谢

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