蒙古牛骨形态发生蛋白（BMPs）基因克隆和组织表达研究

论文摘要

骨形态发生蛋白（BMPs）和生长分化因子（GDFs）是TGF-β超家族的重要成员,它们对动物繁殖性能有重要作用,特别是对卵泡的生长发育和动物生殖功能起重要的调节作用。故对BMPs及其受体的分子克隆和不同组织表达进行研究,以期确定BMPs及其受体在牛不同生殖发育阶段所起的作用,并从基因角度上阐明不孕或多胎产生的机制。本研究在其他哺乳动物（人、绵羊、猪、小鼠、鸡等）骨形态发生蛋白研究基础上,首先采用RT-PCR技术克隆了与蒙古牛繁殖性状相关的四种基因,利用生物信息学的方法对这四种基因的分子特征和结构进行了分析和预测,然后利用半定量RT-PCR方法和原位杂交技术在mRNA水平上检测了四种基因在蒙古牛的卵巢、子宫、输卵管和肾脏组织的表达情况。通过上述方法获得如下试验结果:1、采用RT- PCR方法从牛卵巢组织中扩增出四种与繁殖性状相关的转化生长因子超家族成员,分别为BMP15、BMPR-IB、GDF9和BMP4基因的cDNA序列。经鉴定和序列分析,四种基因序列与己知动物的相应序列有较高的同源性,符合TGF-β家族成员的特征。2、应用生物信息学的方法分析了蒙古牛BMP15基因的CDS区、BMPR-IB和BMP4基因3′端序列,其中BMP15 CDS区全长1185bp,由两个外显子组成,编码394个氨基酸。该序列已提交GenBank,序列号为:DQ463368;BMPR-IB基因序列3′端长953bp,编码302个氨基酸。该基因序列已提交GenBank,序列号为DQ489533;利用RACE技术扩增了牛BMP4基因3′端全部序列,序列长1306bp,编码389个氨基酸,其中包括3′末端非翻译区长为121bp和PolyA15个碱基。此序列已登陆GenBank,序列号:AY854957;克隆了牛GDF9基因保守区域,序列长264bp。3、利用生物信息学方法和相关软件分析了牛BMP15、BMPR-IB和BMP4基因的同源性,试验结果表明牛BMP15基因核苷酸序列和绵羊的同源性为98.5%,与猪的同源性为87.6%,与斑马鱼的同源性为29.1%;通过预测牛BMP15蛋白质保守区域,发现存在一个保守区域,在291～394氨基酸处,是TGF-β超家族成员所共有的同源或异源结构域,牛BMP15氨基酸序列存在4个功能位点。牛BMPR-IB基因编码302氨基酸,此序列与人及禽类的核苷酸序列有很高的保守性,根据牛BMPR-IB cDNA推测的氨基酸序列与已知绵羊、山羊、人、猴子、猪、鸡等典型的真核生物氨基酸序列同源性均达到90%以上。对牛BMP4基因序列分析表明,该基因cDNA序列包含有1170bp编码区,3′端氨基酸序列含有BMP家族固有特定位置的7个半胱氨酸,并与人、绵羊、小鼠、大鼠、狗和鸡的核苷酸序列同源比对,发现它们的同源性分别为90.2%、94.2%、90.9%、90.4%、85.4%和73.6%。4、通过RT-PCR技术检测了四种基因的mRNA在牛卵巢、子宫、输卵管和肾脏组织部位的表达情况。四种基因在牛卵巢、子宫、输卵管和肾脏组织中均有表达,只是不同基因在不同组织中的表达丰度不同。5、运用原位杂交技术检测了BMP15基因的mRNA在卵巢中的表达情况。结果表明,BMP15 mRNA在牛卵巢中有表达,且表达部位因卵泡所处发育阶段不同而不同:在初级卵泡和次级卵泡早期,牛BMP15 mRNA主要在卵泡的颗粒细胞中有杂交信号,在次级卵泡晚期,BMP15只在卵泡的透明带周围有辐射杂交信号。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图清单
• 附表清单
• 缩略词表
• 1 引言
• 1.1 骨形态发生蛋白（BMPs）及其受体的研究进展
• 1.1.1 BMPs 的发展简史
• 1.1.2 BMPs 及其受体的种类
• 1.1.3 BMPs 基因的克隆
• 1.1.4 BMPs 的染色体定位
• 1.1.5 BMPs 及其受体的结构
• 1.1.6 BMPs 及其受体的生物学功能
• 1.2 BMP15 基因的研究进展
• 1.2.1 BMP15 基因的结构
• 1.2.2 BMP15 基因的生物学功能
• 1.2.3 BMP15 基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 1.2.4 BMP15 的作用机制
• 1.3 GDF9 基因的研究进展
• 1.3.1 GDF9 基因的结构
• 1.3.2 GDF9 基因的生物学功能
• 1.3.3 GDF9 基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 1.3.4 GDF9 与 BMP15 基因在卵巢功能中的协同作用
• 1.3.5 GDF9 和 BMP15 对卵泡发育和排卵率的影响
• 1.3.6 GDF9 和 BMP15 对颗粒细胞和 FSH 的影响
• 1.3.7 GDF9 与 BMP15 的相互作用
• 1.4 BMPR-IB 基因的研究进展
• 1.4.1 BMPR-IB 基因的发现
• 1.4.2 BMPR-IB 基因的结构
• 1.4.3 BMPR-IB 基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 1.5 BMP4 基因的研究进展
• 1.5.1 BMP4 基因的结构
• 1.5.2 BMP4 基因的生物学功能
• 1.5.3 BMP4 基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 1.6 半定量RT-PCR 分析技术
• 1.7 ISH 技术及其探针
• 1.7.1 ISH 技术的原理
• 1.7.2 ISH 技术的特点
• 1.7.3 地高辛标记的cRNA 探针的优点
• 1.8 本研究的目的、意义及研究方法
• 2 研究一蒙古牛部分BMPs 基因cDNA 的克隆及序列分析
• 2.1 实验一蒙古牛BMP15 基因cDNA 的克隆及序列分析
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.2 实验二蒙古牛BMPR-IB 基因的克隆与序列分析
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 结果分析
• 2.3 实验三蒙古牛GDF9 基因的克隆与序列分析
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2.4 实验四蒙古牛BMP4 基因的克隆与序列分析
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.3 结果与分析
• 2.5 讨论
• 2.5.1 关于蒙古牛BMP15 基因的克隆和序列分析
• 2.5.2 关于蒙古牛GDF9 基因的克隆
• 2.5.3 关于蒙古牛BMPR-IB 基因的克隆与序列分析
• 2.5.4 关于蒙古牛BMP4 基因的克隆与序列分析
• 3 研究二蒙古牛不同组织中部分BMPs 基因mRNA 表达研究
• 3.1 实验五蒙古牛不同组织中部分BMPs 基因mRNA 半定量RT-PCR 分析
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 结果与分析
• 3.2 实验六蒙古牛BMP15 基因在组织中的原位杂交定位
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 结果与分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 半定量RT-PCR 法的构建
• 3.3.2 内标基因的选定
• 3.3.3 循环次数的确定
• 3.3.4 cRNA 探针的合成策略
• 3.3.5 ISH 技术的应用
• 3.3.6 BMP15 基因的表达分布
• 3.3.7 BMPR-IB 基因的表达及意义
• 3.3.8 GDF9 基因的表达分布
• 3.3.9 BMP4 基因的表达分布
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介