利用RNAi技术抗棉蚜的研究

论文摘要

RNAi作用是细胞内的双链RNA（dsRNA）在Dicer酶的作用下形成-22bp大小的小干扰RNA（siRNA）,siRNA在Ago蛋白的作用下组装到RNA诱导的沉默复合物（RISC）中,从而对靶标mRNA进行切割消化从而抑制其表达翻译。这种基于序列特异性dsRNA对特定基因的沉默作用自其发现就具有用来对昆虫的基因进行下调而达到抗虫并使害虫致死的潜能。在传统的抗蚜方法一切弊病日显严重的情况下,迫切需要寻找新的抗虫策略。而利用RNAi方法抗虫可以有效抵抗虫害,并且安全,而且昆虫进化不易产生对其抗性,这些优点使得RNAi方法成为新的抗虫策略的首选。Mao等人在烟草和拟南芥中表达了靶向棉铃虫细胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA,当棉铃虫进食转基因植物后,体内该基因的表达量明显发生下降,表明发生dsRNA对棉铃虫体内该基因发生沉默作用。Baum的研究中发现靶向V型ATP酶A基因（V-ATPase A）的dsRNA可以有效地对内源性的mRNA产生沉默作用。在利用RNAi进行抗蚜虫研究时,一方面需要选择效率高的靶标dsRNA,另一方面需要产生高通量的dsRNA,此外还要保证转基因植物产生的dsRNA可以在昆虫进食时运输到昆虫体内并发挥RNAi作用。因此本研究中选择了的靶标dsRNA基因有V-ATPaseA,组织蛋白酶基因Cathepin B,核糖体蛋白Ribosomal protein L18, vesicle-fusing ATPase（小囊泡融合ATPase基因）。另外,由于蚜虫在进食植物时,以口器吸食植物韧皮部营养成分,为刺吸式进食,因此研究中选择了韧皮部特异性表达的双向启动子RolC来表达dsRNA,并且结合ToMV病毒的外壳蛋白和起始组装序列（OAS）对病毒RNA的包裹作用,在双向启动子的另一端表达了ToMV的CP蛋白基因,以期可以产生对dsRNA一定的包裹作用而在昆虫进食时运输到昆虫中肠内发挥RNAi作用,并且对于颈环结构的dsRNA的环形结构序列结构选择了ToMV病毒的OAS。研究中针对所选的基因构建5个韧皮部特异性表达的干扰载体,双向启动子一端表达dsRNA,另一端表达CP蛋白基因。构建成功的干扰载体通过农杆菌介导的方法导入到野生型拟南芥中,对获得的转基因拟南芥进行PCR鉴定。另外还对转基因拟南芥进行RT-PCR和Northern检测干扰载体在转基因植物体内的RNA表达情况。此外还对转基因拟南芥接种棉蚜,进行抗蚜数据统计检测其抗蚜效价。实验中成功构建了5个韧皮部特异性表达的干扰载体并将其转入到野生型拟南芥中获得转基因拟南芥。对转基因拟南芥的PCR鉴定显示干扰载体成功转入拟南芥DNA中。RT-PCR和Northern表明转基因拟南芥成功表达dsRNA。而抗蚜实验数据显示效果不明显,有些对蚜虫没什么抗性,这可能是因为实验过程中对蚜虫产生损害而导致实验数据不明显以及实验过程不严谨造成的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词及英汉对照
• 第一章 文献综述
• 1.1 蚜虫简介及其危害
• 1.2 传统抗蚜方法
• 1.2.1 植物自身的抗生性机制
• 1.2.2 天敌的防治
• 1.2.3 药物防治
• 1.3 植物基因工程抗虫
• 1.3.1 Bt抗虫棉
• 1.3.2 蛋白酶抑制剂
• 1.3.3 外源凝集素
• 1.4 RNA技术抗虫
• 1.4.1 RNA干扰作用
• 1.4.2 RNAi的抗虫研究
• 1.4.3 RNAi作用的系统性
• 1.4.4 昆虫的dsRNA饲喂实验
• 1.5 利用RNAi培育具有抗虫性转基因植物的研究
• 1.6 转基因植物体内dsRNA的表达及其在昆虫体内的运输
• 第二章 干扰载体的构建
• 2.1 干扰载体的基本组成及步骤介绍
• 2.1.1 干扰载体的组成
• 2.1.2 构建步骤
• 2.1.3 干扰基因的选择
• 2.2 材料与试剂
• 2.2.1 棉蚜
• 2.2.2 菌株与质粒
• 2.2.3 主要试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 方法
• 2.4.1 棉蚜RNA的提取及cDNA的合成
• 2.4.2 棉蚜基因Cath5,R18,VA,VA2,DL干扰片段的克隆
• 2.4.3 ToMV病毒的起始组装序列（OAS）和CP蛋白基因以及NOST终止子序列的扩增
• 2.4.4 PCR扩增产物的回收
• 2.4.5 载体构建步骤
• 2.4.6 载体构建步骤
• 2.5 结果分析
• 2.5.1 干扰片段以及NOS-T、CP和OAS的扩增
• 2.5.2 中间表达载体的构建
• 2.5.3 干扰表达载体的构建
• 第三章 农杆菌转化拟南芥及其鉴定
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 农杆菌GV3101的电击转化
• 3.1.2 农杆菌转化子的鉴定
• 3.1.3 农杆菌介导的拟南芥转化
• 3.1.4 阳性转化子的筛选
• 3.1.5 阳性植株的鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 农杆菌转化
• 3.2.2 转基因拟南芥的获得和鉴定
• 第四章 转基因拟南芥的表达分析
• 4.1 实验材料及试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 RT-PCR
• 4.2.2 Northern检测RNA水平的表达
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RT-PCR
• 4.3.2 Northern检测分析
• 第五章 转基因拟南芥的抗蚜效果检测
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果分析
• 第六章 结果与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表