南瓜多糖的修饰、结构分析及抗氧化活性的研究

论文摘要

南瓜不仅具有很好的食用价值,还具有降血糖、调血脂、降血压等功效,具有重要的研究与开发价值。本文以南瓜（Cucurbit moschata Duch）为原料,对南瓜多糖的提取、分离纯化、理化性质、化学修饰、结构分析、生物活性等方面进行了系统的研究,得到如下结论:1.采用热水浸提法和超声波辅助提取法提取南瓜多糖。南瓜多糖的热水浸提法的最佳工艺条件为:提取温度为85℃,提取时间为2.5h,料液比为1:20:在此条件下南瓜多糖的实际得率可达4.31%,总糖含量和糖醛酸含量分别为:62.59%,29.11%。超声波辅助提取法的南瓜多糖的总糖含量、糖醛酸含量和提取率分别为:42.11%、29.24%、4.03%。2.对热水浸提法所得南瓜粗多糖（WPP0）和超声波辅助提取法所得南瓜粗多糖（UPP0）经CTAB法、DEAE-纤维素柱层析和凝胶柱层析法得到五个组分:WPP1、WPP2、WPP 2-1、UPP1、UPP2。对这五个组分进行单糖组成分析、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、红外光谱、原子力显微镜（AFM）、核磁共振（1H NMR、13C NMR）分析,得到如下结论:（1） WPP0由果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖构成;鼠李糖、葡萄糖和半乳糖构成主链核心;支链或主链的末端残基由果糖、鼠李糖和葡萄糖构成。南瓜多糖的单糖残基以吡喃环的形式存在。AFM证明WPP0存在具有链状结构,且有多个侧链。（2）水提南瓜PP1多糖（WPP1）的平均分子量为2.41×105Da。由果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖构成;葡萄糖构成主链核心;支链或主链的末端残基由果糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖构成。糖链中含有1→2、1→3、1→4及1→6糖苷键或分枝末端基。AFM证明WPP1存在具有链状结构,且有多个侧链。（3）水提南瓜PP2多糖（WPP2）的平均分子量为2.00×102Da。由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖构成;葡萄糖和半乳糖构成主链核心;支链或主链的末端残基由鼠李糖和阿拉伯糖构成。糖链中含有1→2、1→3、1→4及1→6糖苷键或分枝末端基。AFM证明WPP02存在具有链状结构,且有多个侧链。（4） UPP0由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。主链由果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖构成;果糖、鼠李糖和葡萄糖构成主链核心;支链或主链的末端残基由鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖构成。AFM证明WPP0存在具有链状结构,且有多个侧链。（5）超声提南瓜PP1多糖（UPP1）的平均分子量为2.08×105Da。由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖构成;鼠李糖和葡萄糖构成主链核心;支链或主链的末端残基由果糖、鼠李糖和葡萄糖构成。糖链中含有1→2、1→3、1→4及1→6糖苷键或分枝末端基。AFM证明UPP1存在具有链状结构,且有多个侧链。（6）超声提南瓜PP2多糖（UPP2）的平均分子量为2.16×105Da。由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖构成;鼠李糖和葡萄糖构成主链核心;支链或主链的末端残基由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖构成。糖链中含有1→2、1→3、1→4及1→6糖苷键或分枝末端基。AFM证明UPP2存在具有链状结构,且有多个侧链。（7）水提南瓜PP2-1多糖（WPP2-1）的平均分子量为1.93×104Da。由葡萄糖和半乳糖组成。主链由葡萄糖和半乳糖构成;葡萄糖构成主链核心;无支链或主链的末端残基。糖链中含有1→4、1→6糖苷键或分枝末端基。AFM证明WPP2-1存在具有链状结构,且呈半开口环状。NMR结果表明WPP2-1个残基的连接方式为α-Gal（1→6）;α-Glu（1→4）;β-Gal（1→4）。3.实验采用氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法和三氧化硫-吡啶法对WPP0硫酸酯化效果进行了比较。发现氯磺酸-吡啶法反应条件温和、产物回收容易、收率较高,浓硫酸法和三氧化硫—吡啶法制备过程相对比较简单,但取代度和收率都过低。综合比较后认为氯磺酸-吡啶法是对南瓜多糖较为理想的硫酸化方法。实验最优条件为:反应时间1h、反应温度100℃、氯磺酸和吡啶用量比例为1:2.5。4.在NaOH水溶液中,以氯乙酸为羧甲基化试剂,取代度为目标,对南瓜多糖进行羧甲基化,确定制备高取代度羧甲基南瓜多糖的条件。发现二次加碱法优于一次加碱法;以异丙醇作介质时,产物的取代度最高;改变醚化剂加入的顺序可以提高产物的取代度。结果表明,使用二次加碱法,70%乙醇为介质并改变醚化剂的加入顺序可以制备出高取代度的羧甲基化南瓜多糖。5.对12种南瓜多糖（WPP0、SWPP0、WPP1、SWPP1、WPP2、SWPP2、UPP0、SUPP0、UPP1、SUPP1、UPP2、SUPP2、WPP0）进行抗氧化研究,结果表明不同的南瓜多糖均能有效抑制羟自由基,并随着用量的增加清除作用增强,但经硫酸酯化后对羟自由基清除作用有所减弱;未硫酸酯化的南瓜多糖对超氧阴离子自由基无清除作用,经硫酸酯化后对超氧阴离子自由基均有明显清除作用,且随着加入量的增加清除率增加,呈明显量效关系;这些证明了化学基团的引入可能会增强多糖的活性、改变了多糖的生物活性。水提南瓜多糖的抗氧化性明显高于超声提南瓜多糖,表明超声提取法对多糖的结构和生物活性有一定的影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.多糖研究概述
• 1.1 多糖的提取、分离纯化与纯度鉴定
• 1.1.1 多糖的提取
• 1.1.2 多糖的分离纯化与纯度鉴定
• 1.1.3 多糖的纯度鉴定及分子量的测定
• 1.2 多糖的结构分析方法
• 1.2.1 化学方法
• 1.2.2 仪器分析法
• 1.3 多糖的生物学功能
• 1.3.1 免疫调节作用
• 1.3.2 抗肿瘤作用
• 1.3.3 抗病毒作用
• 1.3.4 抗衰老作用
• 1.3.5 抗凝血作用
• 1.3.6 降血糖作用
• 1.4 多糖分子修饰
• 2.南瓜研究概况
• 2.1 南瓜的营养成分研究
• 2.2 南瓜的药用价值研究
• 2.2.1 降血糖功能
• 2.2.2 预防动脉粥样硬化和冠心病作用
• 2.2.3 防癌、治癌功效
• 2.2.4 解毒、保肝肾、抗氧化功能
• 2.2.5 其他功能
• 2.3 南瓜多糖的研究现状
• 3.本课题的选题依据及主要研究内容
• 第2章 南瓜多糖的提取
• 1.材料和方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 材料的预处理
• 2.2 南瓜多糖的提取
• 2.2.1 南瓜多糖的热水提取法
• 2.2.2 南瓜多糖的超声波辅助提取法
• 2.2.3 南瓜多糖正交提取的实验设计
• 2.3 南瓜多糖的化学性质鉴定
• 2.3.1 南瓜多糖的定性鉴定
• 2.3.2 南瓜多糖的定量分析
• 3.结果与分析
• 3.1 单因素结果分析
• 3.1.1 料液比对南瓜多糖得率的影响
• 3.1.2 提取温度变化对南瓜多糖得率的影响
• 3.1.3 提取时间对南瓜多糖得率的影响
• 3.1.4 提取次数对南瓜多糖得率的影响
• 3.2 二次回归正交旋转组合设计实验结果分析
• 3.2.1 三元二次回归方程的建立与检验
• 3.2.2 双因素交互作用对南瓜多糖得率的影响
• 3.2.3 南瓜多糖最佳提取工艺的确定及验证
• 3.3 南瓜多糖的化学性质鉴定
• 3.3.1 南瓜多糖的定性分析结果
• 3.3.2 南瓜多糖的定量分析结果
• 4.结论
• 第3章 南瓜多糖的分离纯化及结构分析
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 南瓜多糖的分离纯化
• 2.1.1 季胺盐沉淀法
• 2.1.2 DEAE-52纤维素柱层析
• 2.1.3 Sephadex G-200柱层析
• 2.2 纯度鉴定
• 2.3 高效凝胶渗透色谱法测定南瓜多糖分子量
• 2.4 气相色谱法测定南瓜多糖的单糖组成
• 2.5 部分酸水解
• 2.6 高碘酸氧化与Smith降解
• 2.6.1 高碘酸氧化
• 2.6.2 Smith降解
• 2.7 红外光谱分析
• 2.8 原子力显微镜（AFM）分析
• 2.9 NMR分析
• 3.结果与分析
• 3.1 南瓜多糖的分离纯化结果分析
• 3.1.1 季胺盐沉淀纯化结果
• 3.1.2 DEAE-52纤维素柱层析纯化结果
• 3.1.3 Sephadex G-200柱层析纯化结果
• 3.2 纯度鉴定
• 3.3 WPP2-1的基本物理性质
• 3.4 WPP0的结构分析
• 3.4.1 单糖组成分析
• 3.4.2 部分酸水解分析
• 3.4.3 红外光谱法分析
• 3.4.4 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.5 WPP1的结构分析
• 3.5.1 分子量的测定
• 3.5.2 单糖组成分析
• 3.5.3 部分酸水解分析
• 3.5.4 高碘酸氧化与Smith降解的结果与分析
• 3.5.5 红外光谱分析
• 3.5.6 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.6 WPP2的结构分析
• 3.6.1 分子量的测定
• 3.6.2 单糖组成分析
• 3.6.3 部分酸水解分析
• 3.6.4 高碘酸氧化与Smith降解的结果与分析
• 3.6.5 红外光谱分析
• 3.6.6 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.7 UPP0的结构分析
• 3.7.1 单糖组成分析
• 3.7.2 部分酸水解分析
• 3.7.3 红外光谱法分析
• 3.7.4 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.8 UPP1的结构分析
• 3.8.1 分子量的测定
• 3.8.2 单糖组成分析
• 3.8.3 部分酸水解分析
• 3.8.4 高碘酸氧化与Smith降解的结果与分析
• 3.8.5 红外光谱分析
• 3.8.6 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.9 UPP2的结构分析
• 3.9.1 分子量的测定
• 3.9.2 单糖组成分析
• 3.9.3 部分酸水解分析
• 3.9.4 高碘酸氧化与Smith降解的结果与分析
• 3.9.5 红外光谱分析
• 3.9.6 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.10 WPP2-1的结构分析
• 3.10.1 分子量的测定
• 3.10.2 单糖组成分析
• 3.10.3 部分酸水解分析
• 3.10.4 高碘酸氧化与Smith降解的结果与分析
• 3.10.5 红外光谱分析
• 3.10.6 原子力显微镜（AFM）分析
• 3.10.7 核磁共振（NMR）分析
• 4.结论
• 第4章 南瓜多糖的硫酸酯化
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 硫酸酯化多糖的制备
• 2.1.1 氯磺酸-吡啶法
• 2.1.2 浓硫酸法
• 2.1.3 三氧化硫-吡啶法
• 4浊度法'>2.2 硫酸基的定量测定-BaSO₄浊度法
• 2.3 硫酸化南瓜多糖的理化性质分析
• 2.4 红外光谱分析
• 3 结果与分析
• 3.1 硫酸化南瓜多糖的理化性质
• 3.1.1 硫酸化南瓜多糖的物理性质
• 3.1.2 紫外光谱（UV）分析
• 3.1.3 硫酸化南瓜多糖的化学性质的比较
• 3.2 三种硫酸酯化方法的比较
• 3.3 红外光谱分析
• 3.4 其他南瓜多糖硫酸酯化结果
• 4.结论
• 第5章 南瓜多糖的羧甲基化修饰
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 羧甲基南瓜多糖的制备
• 2.1.1 一次加减法
• 2.1.2 二次加碱法
• 2.1.3 方法改进
• 2.2 取代度的测定
• 2.3 红外光谱分析
• 3.结果与分析
• 3.1 羧甲基南瓜多糖的制备
• 3.2 红外光谱分析
• 4.结论
• 第6章 南瓜多糖抗氧化研究
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 南瓜多糖体外清除羟自由基的作用
• 2.2 南瓜多糖体外清除超氧阴离子自由
• 3.结果与分析
• 3.1 南瓜多糖体外清除羟自由基的作用
• 3.2 南瓜多糖体外清除超氧阴离子自由基的作用
• 4.结论
• 第7章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果