黑曲霉产酶特性研究及其酶制剂在猪饲料中的应用

论文摘要

黑曲霉（Aspergillus niger，An）具备产生多种胞外水解酶的能力。以An FJ-008作为出发菌株，经诱变获得了菌株An SL2-111，通过对发酵工艺的优化，确定了An SL2-111最适培养基组成和适宜的工艺条件，并应用于工业化生产。探讨该菌酸性蛋白酶粗酶液的提取技术和纯酶的分离纯化技术，并对其酶学特性、氨基酸组成、动力学性质和活性必需基团进行了研究。采用RT-PCR和PCR技术对An SL2-111的酸性蛋白酶基因进行了克隆和测序。采用An SL2-111生产饲料复合酶制剂，饲喂35日龄长白×大约克二元猪，能提高猪对营养物质的消化吸收率和生长性能。1 An SL2-111的选育出发菌株An FJ-008通过紫外线、紫外线和亚硝基胍复合诱变后，获得1260个单菌落，从鉴定平板上挑选到139株变异辐度较大的菌株。将139株变异株按水解圈的大小排列，从不同区域均匀取样，共选取16个菌株。经三角瓶固体发酵培养后，用SPSS10.0对16株菌株所产的酸性蛋白酶发酵酶活、纤维素酶发酵酶活和果胶酶发酵酶活进行相关分析，发现酸性蛋白酶发酵酶活与纤维素酶、果胶酶发酵酶活的变化呈正相关，因此选择以酸性蛋白酶发酵酶活的高低作为菌种筛选的依据。采用此依据经3次复筛后，获得1株酸性蛋白酶高产菌株An SL2-111。An SL2-111与An FJ-008在形态上有所区别。前者在基础发酵培养基上培养72 h，每克鲜曲酸性蛋白酶发酵酶活达4525 U、果胶酶发酵酶活达701 5 U、纤维素酶发酵酶活达4497 U，分别比出发菌株An FJ-008提高了97.9％、70.1％和13.4％，而且该菌株经斜面传代培养5代，产酶特性稳定。2 An SL2-111发酵工艺的优化以酸性蛋白酶发酵酶活为响应值，采用单因素搜索和正交试验对An SL2-111固体发酵工艺进行优化，结果表明An SL2-111适宜在高碳低氮的培养基中生长，添加无机氮源对菌株产酶影响不大。发酵培养基本上可分为两个阶段：第一个阶段为生长培养期（0～24 h），这个阶段菌丝大量形成，基本上不产酶；第二为产孢和产酶阶段（24～60 h）。采用配方培养基和工艺，在250 mL三角瓶中进行验证实验，酸性蛋白酶发酵酶活达6428 U／g，果胶酶和纤维素酶发酵酶活分别为8245 U／g和4911 U／g。3酸性蛋白酶粗酶液的提取及其稳定剂的研究比较了不同溶剂从固体发酵物中提取酸性蛋白酶粗酶的效果，结果表明用0.1mol／L乳酸-乳酸钠缓冲液（pH3.5）浸提的效果最好，与2％氯化钠相比回收率提高约50％。在此基础上确立了最适的浸提工艺，即采用10倍的0.1 mol／L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH5.0）于40℃下浸泡60 min后，酸性蛋白酶粗酶的提取较为完全。在对粗酶液的酶学性质进行研究后表明，其适宜pH范围为2.0～4.0。最适作用pH为3.0，pH稳定性范围为3.0～6.0；适宜的温度作用范围为50～60℃，最适作用温度为55℃，粗酶液在30℃和40℃下都较为稳定。粗酶液稳定性的试验结果表明，5％的丁醇、5％的山梨酸钾、氯化钠、明胶、黄原胶和淀粉均有利于粗酶液酶活的保存。粗酶液稳定性长效试验表明1％的黄原胶能使粗酶液的酶活在25℃下保持约45 d。4 An SL2-111酸性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法，从An SL2-111的发酵液中提取了一种酸性蛋白酶，经SDS-PAGE验证该酶纯化水平已达到电泳纯。纯化酶的表观分子量约为47×103，最适pH值为3.0，最适pH范围为2.6～3.6，pH稳定性范围为4.0～5.0，最适温度为60℃，最适温度范围为50～65℃，该酶有较好的热稳定性，在40℃或50℃下处理60 min，仍保持85％以上的活力。Cu2+、Mn2+对纯化酶有激活作用，Hg2+、Ag2+则对纯化酶有轻度的抑制作用。纯化酶的氨基酸组成中，极性酸性氨基酸占17.29％，极性碱性氨基酸占4.50％，极性中性氨基酸占38.50％，其它为非极性氨基酸；N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ，经序列同源性比对，表明该酶与其它曲霉菌株酸性蛋白酶具有极高的同源性。酸性蛋白酶对酪蛋白的水解性能最强，对牛血红蛋白及牛血清白蛋白次之，而对鸡卵清蛋白的水解性能最弱。动力学研究结果表明，酪蛋白的米氏常数最小（Km=0.22g／L），最大反应速度Vmax为555.56μg Tyr／min mL，亲和常数最大（Vmax／Km=2525.27），因此酪蛋白是该酶的最适底物。5 An SL2-111酸性蛋白酶活性必需基团的研究采用N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、对氯汞苯甲酸（PCMB）、N-乙酰咪唑（N-AI）、二硫苏糖醇（DTT）、乙酰丙酮（Acetyl acetone）、顺丁烯二酸酐（MA）、溴代乙酸（BrAc）和碘化-环已基-3-（3-三甲氨基丙基）碳二亚胺（CDC）等8种化学修饰剂对酸性蛋白酶的氨基酸侧链基团进行修饰，然后检测残留酶活，结果表明，色氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基以及二硫键是酶活性必需基团，而氨基、巯基、羧基和精氨酸残基与酶活性无关。6 An SL2-111酸性蛋白酶基因的克隆与序列分析采用RT-PCR和PCR技术从An SL2-111的菌丝体中克隆了酸性蛋白酶的基因序列，该序列包含有1339 bp，包含有4个外显子和3个内含子，与An和Aspergillus saitoi的曲霉胃蛋白酶Ⅰ染色体组DNA的核苷酸序列的同源性达到97％，该基因所编码的蛋白质含有前体，N端70～79位氨基酸序列为SKGSAVTTPQ。7 An SL2-111产饲料复合酶制剂对猪的饲养效果利用An SL2-111发酵生产的饲料复合酶制剂中含有酸性蛋白酶6290 U／g、纤维素酶4909 U／g、果胶酶5196 U／g和淀粉酶52385 U／g，将其按0％、0.5％、1.0％和1.5％的不同添加量，饲喂35日龄长白×大约克二元杂交仔猪128头，试验期为63d，每21d测定一次增重和耗料、营养物质表观消化率和血液生化指标。结果表明，饲料复合酶制剂能够明显提高仔猪的生产性能和营养物质的消化率，粗纤维、粗蛋白、粗灰分、钙和磷表观消化率的差异均达到显著水平（P＜0.05），血清中的总蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖和尿素氮的水平均有不同程度地增加，酶制剂对猪只的心脏、肝脏和肾脏的结构与功能没有影响。所有加酶的处理组中，以0.1％的加酶组效果最好，它能使3个生长阶段的仔猪增重分别比对照组提高13.57％、30.47％和34.10％，料肉比分别降低21.26％、9.88％和13.11％，而且各种营养物质的表观消化率均与对照组有显著差异（P＜0.05）。

论文目录

• 中文摘要及关键词
• 英文摘要及关键词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 饲料酶制剂的研究进展
• 1 饲料酶制剂的发展
• 2 饲料酶制剂的分类及作用机理
• 3 饲料酶制剂在畜禽生产、动物健康和环境保护上的意义
• 4 饲料酶制剂在畜禽和水生动物生产上的应用效果
• 5 影响饲料酶制剂使用效果的主要因素
• 6 饲料酶制剂的发展前景与展望
• 第二章 微生物酸性蛋白酶的研究进展
• 1 酸性蛋白酶的研究概述
• 2 酸性蛋白酶产生菌的菌种选育
• 3 微生物酸性蛋白酶的生产工艺
• 4 影响微生物酸性蛋白酶产量的因素
• 5 微生物酸性蛋白酶的应用
• 6 微生物酸性蛋白酶的分离纯化
• 7 微生物酸性蛋白酶的酶学特性及动力学研究
• 8 提高酸性蛋白酶稳定性的方法
• 9 酸性蛋白酶的结构及酶基因的研究
• 10 应用前景及展望
• 第二部分 前言
• 第三部分 实验
• 第一章 An SL2-111 的选育
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第二章 An SL2-111 发酵工艺的优化
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 酸性蛋白酶粗酶液的提取及其稳定剂的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 An SL2-111 酸性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第五章 An SL2-111 酸性蛋白酶活性必需基团的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第六章 An SL2-111 酸性蛋白酶基因的克隆与序列分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第七章 An SL2-111 产饲料复合酶制剂对猪的饲养效果
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录