新型功能分子BST2单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

论文摘要

BST2（Bone Marrow Stromal Antigen2）骨髓基质细胞抗原2，又被称为CD317，HM1.24或者tetherin，是天然免疫中针对囊膜病毒的应答因子。BST2的cDNA是从由风湿性关节炎衍生出的一种滑液细胞系中克隆出来，当时被认为BST2蛋白参与了前体B细胞生长。BST2能够将vpu蛋白缺失的HIV-1病毒粒子拴在细胞膜上，阻止病毒的释放，BST2因此被命名为“tetherin”。BST2对囊膜病毒的出膜具有广谱的抑制作用，是抗击囊膜病毒疾病的一种天生固有的免疫方式。BST2有如此广谱的抑制病毒作用的原因之一，在于这些病毒都具有源于宿主细胞双层脂膜的囊膜结构，BST2能够通过在病毒出细胞膜时直接拴住病毒而起到抑制作用，而近期研究发现，BST2还具有促进某些病毒进入细胞的功能。随着对BST2功能和结构的不断了解，必将在相关药物开发及疾病控制中发挥更大的作用。本实验利用分子生物学手段，通过软件预测，根据已知的BST2基因序列设计出特异性引物，通过PCR技术扩增得到BST2的基因片段，经过琼脂糖电泳及测序证明我们正确扩增到BST2339bp的基因片段。设计了扩增质粒和表达质粒，将BST2基因片段克隆至质粒中，质粒鉴定正确后，转化至BL21a大肠杆菌表达系统，可溶性表达了BST2的蛋白。镍离子亲和层与凝胶层析纯化蛋白后，测定了蛋白浓度，使抗原达到免疫实验要求。三次免疫Balb/C小鼠，加强免疫后采小鼠脾细胞与复苏的SP2/0细胞株进行融合。经过三个克隆阶段，成功制备了2株鼠源单克隆抗体（McAb），命名为10-1和11-1。经测定效价均为107，Westernblot方法及表面等离子共振技术对其特异性及亲和力等特性进行了检测，结果显示这两株单抗具有较好的特异性和较高的亲和力。采集并分离了HIV感染病人及正常人的外周血，并分离得到了外周血单核细胞（PBMCs）。通过流式细胞技术，利用单克隆抗体及绿色荧光FITC标记的二抗共染了外周血单核细胞，比较了BST2蛋白在HIV感染病人与正常人外周血单核细胞中的表达差异。初步结果显示，感染后人外周血单核细胞表面BST2表达量比正常人血液中的低。BST2蛋白表达、单克隆抗体制备及检测方法的初步应用，为进一步揭示BST2蛋白作用机制、功能及抗病毒药物开发提供详实数据及方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 新型功能分子 BST2 研究进展
• 1.1 BST2 的结构
• 1.2 BST2 对囊膜病毒的抑制作用
• 1.3 病毒对 BST2 的拮抗作用
• 1.3.1 Vpu 蛋白
• 1.3.2 Env 蛋白
• 1.3.3 Nef 蛋白
• 1.3.4 K5 蛋白
• 1.3.5 BST2 抗体
• 1.4 BST2 协助人巨细胞病毒（HCMV）进入细胞
• 1.5 BST2 在天然免疫中可能扮演的其他角色
• 1.6 展望
• 第2章 BST2 基因克隆、表达及纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品及试剂
• 2.1.2 工具酶、试剂盒、分子量标准
• 2.1.3 菌株
• 2.1.4 质粒
• 2.1.5 引物序列
• 2.1.6 常用缓冲液及其他溶液配制
• 2.1.7 分析软件
• 2.1.8 主要仪器及设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 BST2 质粒的构建
• 2.2.2 BST2 蛋白的表达
• 2.2.3 BST2 蛋白的纯化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 BST2 基因克隆
• 2.3.2 pET21a-BST2 质粒的构建与鉴定
• 2.3.3 BST2 蛋白表达鉴定
• 2.3.4 BST2 蛋白纯化
• 2.4 讨论
• 第3章 BST2 单克隆抗体的制备及纯化
• 3.1 材料
• 3.1.1 免疫抗原与检测抗原
• 3.1.2 杂交瘤细胞株
• 3.1.3 实验动物
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 主要溶液
• 3.1.6 其它实验材料
• 3.1.7 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 免疫接种
• 3.2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2.3 单克隆抗体的大量制备
• 3.2.4 单抗纯化
• 3.2.5 特性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 单克隆抗体制备
• 3.3.2 抗体的纯化
• 3.3.3 Western blot 检测 BST2 单抗与 BST2 蛋白的结合
• 3.3.4 BST2 蛋白单克隆抗体与抗原 BST2 蛋白结合的亲和力
• 3.4 讨论
• 第4章 外周血 BST2 表达的初步检测
• 4.1 材料
• 4.1.1 免疫抗原与检测抗原
• 4.1.2 杂交瘤细胞株
• 4.1.3 HIV 外周血
• 4.1.4 实验动物
• 4.1.5 主要试剂
• 4.1.6 主要溶液
• 4.1.7 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.2 杂交瘤细胞复苏及单克隆抗体制备
• 4.2.3 血液外周血单核细胞分离
• 4.2.4 流式细胞仪检测 BST2 表达
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果