论文摘要
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）指日摄入酒精量小于10g而肝脏脂肪沉积大于肝脏总重5%的以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征,NAFLD包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、进展性肝纤维化和肝硬化等一系列肝脏损害的疾病谱。大部分非酒精性脂肪肝病患者长期停留在单纯性脂肪肝的阶段,也简称为“脂肪肝”。近年来,随着人们饮食结构、生活方式的改变,NAFLD的发病率大幅上升,全球普通人群中平均患病率约20%,肥胖及2型糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者中分别达60%和75%,现己成为危害人类健康最常见的肝病。在美国,NAFLD的发病率为24%,NAFLD现已成为西欧、美国、澳大利亚第一大慢性肝病以及肝酶异常的首要病因,而在亚洲国家NAFLD的发病率也逐渐增加。在过去的7-10年,我国发达地区成人脂肪肝患病率大概增加了近一倍,且成人脂肪肝患病率高达15%,其中绝大多数为NAFLD。NAFLD和代谢综合征关系密切,近年研究者逐渐认识到NAFLD是代谢综合征的一个重要组成部分,是代谢综合征的肝脏表现,和心血管发病密切相关。因此,NAFLD的高发病率及其与人类代谢和心血管的密切关系使其成为全球关注的医学研究热点。由于大部分非酒精性脂肪肝病患者长期停留在单纯性脂肪肝的阶段,大部分患者终生停留在单纯性脂肪肝的阶段,一部分患者经过10年以上的时间方逐渐进展为NASH的阶段,故单纯性脂肪肝和代谢综合征的关系更为密切。对其发病的机制的了解将对代谢综合征和心血管疾病的防治有重要意义并为可能的治疗方向提供靶点。饮食因素被认为是导致脂肪肝发生的重要的环境因素。各种不同的饮食因子可以对脂肪肝的发生发展起保护或促进作用。其中果糖对脂肪肝发生发展的影响尤为引人注意,果糖多量存在于软饮料等食品中,随着上世纪70年代高果糖玉米糖浆（HFCS）引入食品加工业后,果糖的人群摄入量逐年增高,特别是一些青少年以软饮料代水引用。流行病学研究发现高果糖摄入与人群的超重、血脂异常、代谢综合征发病相关,动物研究表明,高果糖饮食可致大鼠血脂异常、血糖增高、腹型肥胖及血压升高,表现为较为典型的代谢综合征,故而高果糖饮食的危害也逐渐被认识到。尽管报道不完全一致,人体和动物研究中都证明高果糖摄入有致脂肪肝的作用。大量动物研究报道高果糖饮食可诱导肝脏脂质沉积,短期和长期的高果糖喂养均可在啮齿类动物引起脂肪肝。具体的机制尚不完全明确。根据既往的研究,慢性高果糖、高脂喂养后可诱导大鼠发生肝内脂质沉积和肝脏胰岛素抵抗（IR）的发生,同时伴有各种肝细胞内各种事件的发生,如线粒体脂肪酸氧化功能障碍、脂质从头合成增加、内质网应激、线粒体功能障碍等,但是脂肪肝发生的始动机制、各种肝内细胞事件的发生顺序以及其与脂肪肝的发生的关系尚未阐明,同时,尚缺乏关于短期高果糖过量摄入对肝脏脂质沉积和肝胰岛素敏感性的影响研究。本研究首先观察了短期（一周）高果糖喂养小鼠肝脏脂质含量的变化,在验证了脂肪肝的形成后进一步评价了小鼠机体和肝脏的胰岛素敏感性,并从功能和分子生物学上评价了早期脂肪肝形成时肝内线粒体脂肪酸氧化、脂质合成途径;并通过检测内质网应激相关因子的蛋白和基因的表达,观察脂肪肝发生发展与内质网应激、炎症通路的关系;同时,本研究以高脂饮食喂养作为对照的脂肪肝模型,探讨不同饮食因素对小鼠肝脏的影响和可能的早期发生机制,从而对高果糖饮食的危害和脂肪肝的发生机制有进一步的了解（本研究于澳大利亚悉尼加尔文医学研究所完成）。第一部分短期高果糖、高脂喂养对小鼠肝脏甘油三酯及肝胰岛素敏感性的影响目的:探讨短期高果糖、高脂饮食对肝脏脂肪沉积的作用及其对肝脏胰岛素敏感性的改变。方法:12-15周龄C57BL/J6小鼠106只（由澳大利亚Perth动物中心提供）。小鼠于温度控制在22±1℃的动物饲养中心喂养,室内光线为12小时白日/12小时黑夜循环;适应性喂养一周后,随机分为3组:对照组（Con）36只、高果糖组（HFru）35只、高脂组（HF）35只,对照组给予基础饲料（standard lab chow diet,Gordon’s Specialty Stock Feeds, Yanderra, Australia）,热量组成（见表1）:碳水化合物71%,脂肪8%,,蛋白质21%,总热量为260kcal/100g;高果糖组给予高果糖饮食,热量组成:碳水化合物70%（其中果糖含35%）,脂肪9%,,蛋白质21%,总热量为260kcal/100g;高脂组给予高脂饲料,其热量组成:碳水化合物20%,脂肪59 %,蛋白质21%,总热量为540kcal/100g。为评估肝脏胰岛素敏感性,于喂养后一周后每组随机选8只小鼠,行腹膜下糖耐量试验（ipGTT）;另外每组随机选取8只小鼠,于喂养一周末禁食10小时过夜,自小鼠尾部采血,应用低温离心机离心后取血浆,用于测定空腹血胰岛素（INS）及血浆TG。实验结束后以断颈法处死小鼠,立刻取出肝脏组织,迅速放入-70℃液氮中保存。将冻存肝组织匀浆,氮气吹干,以GPO-PAP法测量TG含量。于喂养一周末每组随机取12只小鼠,禁食10小时过夜,每组小鼠随机选取6只小鼠注射生理盐水,另向6只小鼠腹腔内注射含有葡萄糖（3g/kg BW）、胰岛素（2U/kg.BW）的混合溶液,于注射后40分处死小鼠,其后留取肝脏组织,冻存于-70度。应用western blot方法测定前述胰岛素葡萄糖混合溶液注射后40分钟小鼠肝脏组织的蛋白激酶B （PKB/Akt,本文简称Akt）和糖原合成激酶-3α/β（GSK-3α/β）的总蛋白和磷酸化蛋白的表达。通过比较各组注射与未注射胰岛素溶液的小鼠p-Akt/t- Akt（磷酸化Akt/总Akt）和p- GSK-3β/t- GSK-3β表达变化评估胰岛素敏感性。结果:1各组小鼠体重及血生化指标的结果:不同饮食喂养一周后,各组小鼠间体重无明显差异（p>0.05）;高果糖组和高脂组的单位体重附睾脂肪含量明显高于对照组（P<0.01）。各组间空腹血糖、胰岛素和血浆游离脂肪酸、血浆甘油三酯（TG）无明显差异（p>0.05）。2肝脏TG含量变化:与对照组相比,高果糖组和高脂组肝脏甘油三酯含量显著升高,差异有统计学意义（P<0.01）;其中高果糖组肝脏甘油三酯堆积较高脂组更显著（P<0.01）。3腹膜下葡萄糖耐量实验（ipGTT）:与对照组相比,高果糖组和高脂组30′、60′、90′血糖显著升高,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;与对照组相比,高果糖组和高脂组的葡萄糖曲线下面积显著高于对照组（分别增加58%和64%）,差异有统计学意义（P<0.01）。4肝脏胰岛素敏感性评估:与对照组相比,高果糖组和高脂组小鼠基础状态时p-Akt/t- Akt和p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β的比值无明显差异（p>0.05）;胰岛素注射40min后,与对照组相比,高果糖组和高脂组的p-Akt/t- Akt分别减少57%和42%（P均<0.01）,差异有统计学意义;高果糖组和高脂组的p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β的比值分别减少53%和52%（P均<0.01）,差异有统计学意义（P均<0.01）,提示高果糖组、高脂组小鼠的肝脏对胰岛素敏感性减低,信号传导减弱;胰岛素注射后,高果糖组、高脂组两组间p-Akt/t- Akt和p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β的比值无明显差异（p>0.05）。结论:1短期高果糖和高脂饮食喂养均可引起小鼠肝脏脂质沉积。2短期高果糖和高脂饮食喂养均可引起小鼠糖耐量下降和肝脏IR发生。3高果糖和高脂饮食喂养一周时,小鼠肝脏脂质沉积和肝IR并存。第二部分短期高果糖、高脂喂养对小鼠肝脏内源性脂质合成代谢的影响目的:从功能和分子水平两方面全面的探讨了短期高果糖、高脂饮食摄入时肝脏脂质从头合成途径的变化方法:动物分组及标本取得同第一部分。从功能上,通过核素示踪方法评估了肝脏内源性脂质从头合成率,应用放射性3H标记H2O测定肝内源性脂质合成率。肝脏固醇调节元素结合蛋白（SREBP）、碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）的mRNA表达的测定采用实时荧光定量RT-PCR分析技术。应用Western-blot法分析肝脏脂质从头合成关键酶------包括乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、硬脂酰CoA脱饱和酶-1（SCD-1）------的蛋白表达。结果:1各组小鼠肝细胞脂质从头合成率比较:与对照组相比,高果糖组肝细胞脂质从头合成率增加63% （p<0.01）,高脂组肝细胞脂质从头合成率减少32% （p<0.05）,差异有统计学意义,提示高果糖喂养促进肝脏脂质合成,高脂喂养时肝脏脂质合成受抑制。2各组小鼠肝脏SREBP和ChREBP基因表达比较:与对照组相比,高果糖组的肝内SREBP增加330%（p<0.01）,ChREBP基因表达增加44% （p<0.05）;高脂组的肝脏SREBP基因表达增加50%（p<0.01）,ChREBP基因表达无变化（p>0.05）。3各组小鼠肝脏脂质从头合成关键酶表达比较。与对照组相比,高果糖组肝脏FAS蛋白表达增加2.7倍（p<0.01）、ACC蛋白表达增加6.4倍（p<0.01）、SCD-1蛋白表达增加8.0倍（p<0.01）;相反,与对照组相比,高脂组ACC蛋白表达下降45%（p<0.01）、SCD-1蛋白表达下降78%（p<0.01）。结论:1高果糖饮食和高脂饮食对肝脏脂质从头合成的影响相反;高果糖饮食使内源性脂质生成率增加,高脂饮食抑制肝内源性脂质生成率。2短期高果糖饮食喂养明显增加肝脏脂质合成酶类的上游转录因子SREBP和ChREBP的基因表达水平;短期高脂饮食喂养可增加肝脏SREBP的基因表达水平,但增加的程度明显小于高果糖饮食;高脂饮食未明显改变ChREBP的基因表达水平。3高果糖饮食可明显促进肝脏脂质合成酶类ACC、SCD-1和FAS的蛋白表达;而高脂饮食喂养时,肝脏脂质合成酶类ACC和SCD-1蛋白表达受抑制。第三部分短期高果糖、高脂喂养食诱导脂肪肝的肝脏线粒体功能探讨目的:探讨短期高果糖、高脂饮食致小鼠脂肪肝发生时肝脏内线粒体功能的改变。方法:动物分组及标本取得同第一部分。从功能上,通过核素示踪方法评估了肝脏线粒体底物氧化率测定,应用放射性[1-14C]标记的棕榈酸（palmitate acid）测定肝细胞线粒体棕榈酸氧化率;应用放射性[1-14C]标记的谷氨酸测定肝细胞线粒体谷氨酸氧化率。应用Western Blot方法测定线粒体生成和代谢等相关的标志蛋白——包括线粒体生成相关的上游因子增殖体活化受体共激活子-1α（PGC1α）、提示线粒体数量的蛋白电压依赖性阳离子通道蛋白（VDAC）、线粒体脂肪酸氧化关键酶棕榈基转移酶Ⅰ（CPT-1）、以及线粒体呼吸链亚单位蛋白（ComplexI、II、III、V:应用一个可识别线粒体呼吸链的数个亚单位的WesternBlot鸡尾酒抗体）和细胞色素氧化酶亚单位-1（COX-1（相当于ComplexIV））——的表达水平。结果:1各组小鼠肝细胞线粒体棕榈酸氧化率:与对照组相比,高果糖组、高脂组的棕榈酸氧化率无明显增高或降低,差异无统计学意义（P均>0.05）。2各组小鼠肝细胞线粒体谷氨酸氧化率:与对照组相比,高果糖组、高脂组的谷氨酸氧化率无明显增高或降低,差异无统计学意义（P均>0.05）。3各组小鼠肝细胞线粒体代谢标志蛋白表达比较:提示线粒体合成的蛋白PGC1-α在各组之间的蛋白表达无显著差异（P>0.05）;提示线粒体数量的蛋白VDAC在各组之间的蛋白表达无显著差异（P>0.05）;提示线粒体脂肪酸氧化代谢的CPT-1在各组之间的蛋白表达无显著差异（P>0.05）。4各组小鼠肝细胞线粒体呼吸链蛋白表达比较:与对照组相比,高果糖组、高脂组的线粒体呼吸链亚单位蛋白ComplexI、ComplexII、ComplexIII、ComplexV的蛋白表达均无显著差异,各组之间各线粒体呼吸链蛋白复合体表达无显著差异（P>0.05）;另一提示线粒体代谢的蛋白COX-1在各组之间的蛋白表达无显著差异（P>0.05）。结论:1短期高果糖饮食和高脂饮食引起脂肪肝的同时,肝细胞内线粒体底物氧化功能无明显减弱。2短期高果糖饮食和高脂饮食引起脂肪肝的同时,线粒体生成和代谢相关标志蛋白包括PGC1α、VDCA、CPT-1、线粒体呼吸链线粒体呼吸链亚单位蛋白（ComplexI、II、III、V）和COX-1的蛋白表达均无明显变化。第四部分肝脏内质网应激（ERS）与高果糖、高脂饮食诱导脂肪肝的关系目的:了解短期高果糖、高脂饮食喂养诱导脂肪肝发生时内质网的功能情况,从而探讨不同饮食因素诱导脂肪肝的发生机制及其与内质网应激的关系。方法:动物分组及标本取得同第一部分。应用Western Blot方法测定肝脏内内质网应激的标志物胰腺内质网激酶（PERK）、肌醇要求酶-1（IRE-1）、真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化蛋白表达;应用PCR（Polemerase Chain Reaction）方法测定X盒连接蛋白-1（XBP-1）的剪切形式XBP-1s的mRNA水平。结果:1与对照组相比,高果糖组的肝脏上游调节蛋白PERK的磷酸化蛋白（p-PERK）含量增加2.2倍（P<0.01）,其下游因子eIF-2α的磷酸化（p-eIF-2α/t-eIF-2α）亦增加2.6倍（P<0.01）;另一条通路的上游调节蛋白IRE-1的磷酸化（p- IRE-1 /t- IRE-1）增加2.1倍（P<0.01）,与之相应,下游的XBP-1的剪切形式XBP-1s的mRNA水平显著增加1.15倍（P<0.01）,提示一周喂养时高果糖组小鼠存在肝脏内质网应激。2与对照组相比,高脂组小鼠肝脏的p-PERK、p- eIF-2α/t-eIF-2α、p- IRE-1 /t- IRE-1的蛋白表达无明显变化（P均>0.05）,XBP-1s的mRNA水平也没有明显变化（P>0.05）,提示一周喂养时高脂组小鼠无肝脏内质网应激。结论:1高果糖饮食在短期内诱导出小鼠脂肪肝和肝IR的同时,小鼠肝脏出现内质网应激,ERS可能介导了小鼠脂肪肝和肝IR的发生。2高果糖饮食和高脂饮食对内源性脂质合成和内质网应激的相反影响提示ERS和脂质合成密切相关,具体因果关系尚待进一步研究。3短期高脂喂养小鼠脂肪肝和IR早于ERS发生,提示ERS不是高脂喂养小鼠脂肪肝和肝IR发生的始动机制。第五部分短期高果糖、高脂饮食喂养诱导脂肪肝的炎症因子变化目的:了解高果糖、高脂饮食诱导脂肪肝早期出现时炎症通路的变化,从而进一步探讨不同饮食因素诱导脂肪肝的发生机制及其与肝IR的关系。方法:动物分组及标本取得同第一部分。应用Western Blot方法测定小鼠肝脏内两条主要炎症通路c-Jun氨基末端激酶（JNK）途径和I kappa B激酶α/β（IKK-α/β）-核因子κB （NF-κB）途径的蛋白表达变化（由于NF-κB蛋白检测不稳定,本实验选取了p-IKK-α/β和t-IκB ）作为反应这条通路的指标。结果:1与对照组相比,高果糖组小鼠肝脏的p-JNK/tJNK、p -IKK-α/β/t- IKK-α/β和t-IKB 的蛋白表达无明显变化（P均>0.05）。2与对照组相比,高脂组小鼠肝脏的磷酸化JNK增加（p-JNK/tJNK）2.0倍（ p<0.01）,提示高脂喂养小鼠JNK通路激活;与对照组相比,高脂组的磷酸化IKK-α/β（p -IKK-α/β/t- IKK-α/β）和t-IκB蛋白含量均无明显变化（p均>0.05）。结论:1短期高果糖喂养出现的脂肪肝和IR不伴有肝内炎症通路JNK通路和IKK-α/β通路的激活。2短期高脂喂养小鼠出现脂肪肝和IR的同时,肝脏内JNK通路激活,JNK通路可能介导高脂喂养小鼠的肝IR;IKK-α/β通路无变化。
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