论文摘要
本文研究了微生物Absida sp.A3r菌产黄芪皂苷糖苷酶的分离纯化和酶性质,重点考察了黄芪总皂苷酶反应产物中黄芪甲苷和其他酶转化后低糖基黄芪皂苷的分离纯化。初步探索了黄芪皂苷糖苷酶的酶解原理。Absidasp.A3r菌所产的酶,具有黄芪皂苷糖苷酶活性,本论文确定了酶活检测方法并且研究了酶性质。粗酶液经DEAE-CelluloseDE52柱进行梯度洗脱,在KCl盐浓度为120mmol/L下,洗脱出黄芪皂苷糖苷酶。经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检测,图谱显示为单一的单带,确定其酶蛋白分子量约为50kDa。提纯酶进行酶性质研究,结果如下:酶反应体系的最适底物浓度3.0%;最适pH为5.0,pH值稳定范围为pH4.07.0;酶反应体系的最适温度为35℃,20℃～50°℃范围内稳定性较好,最适反应时间为28h。酶反应产物采用AB-8和D-280型大孔吸附树脂纯化。确定了 AB-8树脂柱的洗脱剂为60%70%的乙醇溶液,将洗脱液通过D-280树脂柱,收集流出液;并用95%的乙醇将树脂柱中的皂苷类物质全部洗脱下来,收集洗脱液,与流出液合并,浓缩,干燥,得率为12.70%。用硅胶柱层析进一步分离,以洗脱剂V（氯仿）:V（甲醇）9.0:1.0进行洗脱,TLC检测得到纯度较高的5种单带为:黄芪甲苷、黄芪皂苷a,b,d,e及其他皂苷混合物。洗脱出的黄芪甲苷干燥称重为0.1037g,得率为6.91%。经高效液相色谱检测,酶解后的黄芪甲苷的产率提高到9.68%,硅胶柱分离得到的黄芪甲苷的纯度为:62.92%。黄芪皂苷糖苷酶反应原理初步确定为:黄芪皂苷糖苷酶将带有三个糖基的黄芪皂苷脱去鼠李糖基,生成黄芪甲苷。
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摘要Abstract第一章 文献综述1.1 黄芪简介1.1.1 黄芪的植物形态、生长环境1.1.2 黄芪的分类1.1.3 黄芪中的化学成分1.2 黄芪的药理作用1.2.1 增强机体免疫功能1.2.2 保肝脏、促进机体代谢1.2.3 抑菌及抑制病毒作用1.3 黄芪皂苷的结构特点1.4 黄芪皂苷糖苷酶的研究进展1.5 本论文的主要研究内容第二章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 菌种2.1.2 培养基2.1.3 试剂与仪器2.2 实验方法2.2.1 菌种培养2.2.2 黄芪皂苷糖苷酶粗酶液的提取2.2.3 粗酶液中黄芪皂苷糖苷酶活力测定2.2.4 黄芪皂苷糖苷酶的分离纯化2.2.4.1 DEAE-Cellocuse DE52柱的处理与装柱2.2.4.2 酶的上柱与分离2.2.5 黄芪皂苷糖苷酶性质研究2.2.6 黄芪皂苷酶纯度检测及分子量测定2.2.6.1 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳的基本原理2.2.6.2 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量2.2.7 黄芪皂苷含量测定方法2.3 酶反应产物的制备与分离提取2.3.1 酶反应产物的制备2.3.2 酶解产物的AB-8大孔吸附树脂的纯化2.3.3 酶解产物的D280树脂的处理2.3.4 黄芪皂苷酶解产物纯化分离2.3.5 高效液相色谱（HPLC）检测2.3.6 酶反应原理初步确定第三章 结果与讨论3.1 产黄芪皂苷糖苷酶的提取与鉴定3.1.1 DEAE-Cellulose DE52柱分离纯化粗酶液3.1.1.1 HAc-NaAc缓冲液体系初步分离粗酶液3.1.1.2 HAc-NaAc缓冲液体系进一步分离粗酶液3.1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测提纯酶纯度3.1.3 黄芪皂苷糖苷酶的分子量测定3.2 酶反应底物制备3.3 黄芪皂苷糖苷酶活力测定3.3.1 标准品黄芪甲苷标准曲线绘制3.3.2 样品中黄芪甲苷含量测定3.4 黄芪皂苷糖苷酶性质研究3.4.1 酶反应的最佳底物浓度3.4.2 酶反应最佳时间3.4.3 酶反应的最适pH3.4.4 酶反应的pH稳定性3.4.5 酶反应的最适温度3.4.6 酶反应的温度稳定性3.5 酶反应产物的分离纯化3.5.1 D280树脂的脱色处理3.5.2 AB-8大孔吸附树脂的脱糖及产物初步分离3.5.3 酶反应产物的硅胶柱法分离提纯3.5.4 黄芪皂苷糖苷酶的酶反应原理初步分析3.6 HPLC检测第四章 结论参考文献致谢
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