串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究

论文摘要

小鹅瘟（Gosling Plague）是严重危害水禽养殖业的重要传染病之一,其防制措施主要依靠疫苗接种,传统疫苗在预防和控制小鹅瘟时,存在着散毒和免疫应答不完全等缺点。基因疫苗符合未来疫苗的发展方向,具有安全和诱导全面的免疫应答等诸多优点。本研究以小鹅瘟病毒（Goose Parvovirus,GPV）VP3为研究对象,构建了VP3单基因DNA疫苗,为了增强VP3基因疫苗的免疫原性,将鹅白介素-2（Goose Interleukin-2,gIL-2）和VP3基因进行串联融合表达,还嵌入了一段CpG免疫刺激序列,将构建的三种基因疫苗分别免疫28日龄雏鹅和种鹅,并对其诱导鹅产生的体液免疫和细胞免疫进行了比较研究,为研制高效小鹅瘟病毒VP3基因疫苗打下了基础。1.为了探索GPV VP3基因构建基因疫苗的可行性,通过PCR扩增和基因重组技术克隆了GPV VP3基因并将其连接到pMD18T-Simple上,在对VP3基因分子特性、遗传特点和抗原性进行了分析之后,亚克隆到pcDNA3.1（+）CMV启动子下游的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了单独表达GPVVP3基因的基因疫苗载体pcDNA-VP3,将其转染真核细胞COS-7后,利用间接免疫荧光抗体试验可以在转染后48h检测到VP3基因的高效表达。2.通过重叠延伸PCR（Splicing by overlap extention PCR）扩增gIL2-VP3串联基因,包含缺失了TAA终止密码子的gIL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP3基因,两个基因之间以高亲水性氨基酸（Gly-Gly-Gly-Ser）编码核苷酸相连接;将gIL2-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到到pcDNA3.1（+）CMV启动子的下游HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了表达gIL2-VP3融合基因的pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。3.人工合成在禽体内具有免疫刺激作用的CpG序列,克隆到pMD18T-Simple载体上,然后亚克隆定向插入到pcDNA-gIL2-VP3目的基因终止密码子后的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,构建成pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗载体,对鹅外周淋巴细胞增殖具有较强的刺激活性（SI=3.06）。4.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg的不同剂量分别免疫28日龄鹅,分别于基因免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d和49d颈静脉采集免疫鹅的抗凝血,分离外周血淋巴细胞后,利用MTT比色法检测ConA对鹅外周血淋巴细胞增殖的免疫刺激作用,发现鹅在免疫pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG后第28d体内细胞免疫最强,200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫组外周血淋巴细胞的ConA刺激指数显著高于pcDNA-gIL2-VP3各组（P＜0.05）;显著高于单基因基因疫苗pcDNA-VP3各个剂量组（P＜0.05）。含有佐剂的pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG两种基因疫苗细胞免疫的峰值比单基因VP3 DNA疫苗提前7d。5.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg不同剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、105d、133d、161d、189d、217d,采用间接ELISA的方法检测鹅体内IgG的动态变化规律,结果显示,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG所诱导的体液免疫水平明显高于pcDNA-VP3单基因组,这两种基因疫苗的各个剂量组均在第35d抗体水平达到最高,其中以200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG的ELISA水平最高,显著区别于pcDNA-VP3各剂量免疫组（P＜0.05）和极显著高于各个对照组（P＜0.01）。从pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG诱导鹅的体液免疫强度和维持时间来看,均优于pcDNA-VP3免疫鹅和GPV弱毒免疫鹅。6.将三种基因疫苗以200μg的剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第15d、30d、45d、60d和75d,采用微量血清中和试验检测基因免疫所诱导的中和抗体水平,结果显示,免疫后第15d就可以检测到中和抗体,鹅血清中和抗体随时间的推移稳定中有所缓慢上升,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫后第60d的鹅血清中和抗体平均效价分别达到峰值1:178.5和1:198.2,二者之间差异不显著,但是显著高于pcDNA-VP3和GPV弱毒免疫鹅（P＜0.05）。7.将三种GPV VP3基因疫苗以200μg的剂量肌肉注射免疫开产前母鹅,分别在免疫后第7d、14d、28d、42d、56d和第70d收集免疫母鹅所产鹅蛋用作卵黄抗体的检测,另外在免疫后第14d、28d、42d取一批鹅蛋入孵用以孵化小鹅用作雏鹅攻毒保护试验。结果显示不同时间卵黄抗体和中和抗体水平与雏鹅攻毒保护率呈现一定的正相关性,三种基因疫苗以pcDNA-gIL2-VP3/CpG效果最好,具有类似于GPV弱毒苗的免疫保护效果。

论文目录

• 本文创新性研究工作
• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 小鹅瘟的研究进展
• 1 小鹅瘟病毒的病原学特征
• 1.1 小鹅瘟病毒的理化特征
• 1.2 小鹅瘟病毒的宿主范围和培养特性
• 1.3 基因组分子生物学
• 1.4 蛋白质分子生物学
• 2 流行病学
• 3 临床症状和病理变化
• 3.1 肠道变化
• 3.2 其他组织器官的变化
• 4 小鹅瘟诊断方法
• 5 小鹅瘟病毒的基因克隆以及体外编码蛋白的研究
• 6 综合防制
• 7 研究展望
• 第二章 增强基因疫苗免疫效果的策略
• 1 基因疫苗的免疫学优势和所存在的问题
• 1.1 基因疫苗的免疫学优势
• 1.1.1 诱导全方位的免疫应答
• 1.1.2 不同血清亚型的交叉免疫
• 1.1.3 嵌合免疫、多重免疫及联合免疫
• 1.1.4 长期免疫
• 1.1.5 性质稳定,安全性好,受母源抗体影响小
• 1.2 制约基因疫苗免疫效果的因素
• 1.2.1 依赖宿主产生抗原
• 1.2.2 宿主细胞内外屏障
• 1.2.3 抗原表达量低
• 2 增强基因疫苗免疫效果的一些策略
• 2.1 基因疫苗质粒的优化
• 2.1.1 选择强的转录启动子
• 2.1.2 注意密码子的偏嗜
• 2.1.3 构建双向或双顺反子质粒
• 2.1.4 载体中的免疫刺激性序列（ISS）
• 2.1.5 其它元件
• 2.2 免疫接种系统和途径的选择
• 2.2.1 接种方法
• 2.2.2 接种途径
• 2.2.3 免疫动物的预处理
• 2.3 克服细胞内、外屏障
• 2.3.1 使用脂质体、亚精胺和核酸酶抑制剂
• 2.3.2 抗原蛋白的泛素化表达
• 2.3.3 内质网转运信号序列
• 2.3.4 基因疫苗的细菌传送系统
• 2.4 优化免疫应答趋向类型
• 2.4.1 和细胞因子共表达
• 2.4.2 共刺激信号分子
• 2.4.3 初次免疫和加强免疫使用相同抗原的不同类型的疫苗
• 第二部分 实验研究
• 第三章 小鹅瘟病毒VP3基因的克隆和分子特性研究
• 1 材料
• 1.1 病毒及核酸
• 1.2 试验动物和鹅胚
• 1.3 质粒与感受态细胞
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 GPV CHv-1强毒株的增殖
• 2.2 病毒基因组DNA的提取
• 2.3 引物设计
• 2.4 VP3基因的PCR扩增
• 2.5 PCR产物的凝胶试剂盒回收和纯化
• 2.6 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备
• 2.7 VP3基因加A尾以及与T载体的连接
• 2.8 重组质粒的转化
• 2.9 碱裂解法小量抽提重组质粒
• 2.10 重组质粒的酶切鉴定及PCR鉴定
• 2.11 VP3基因序列测定
• 2.12 VP3基因及推导蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测
• 3 结果
• 3.1 PCR结果
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3 CHv-1株VP3基因测序结果及其与标准株的比较分析
• 3.4 GPV VP3基因的遗传特点
• 3.5 GPV CHv-1 VP3基因推导蛋白质二级结构预测结果
• 4 讨论
• 4.1 关于GPV VP3基因的PCR扩增
• 4.2 GPV CHv-1株VP3基因的序列测定和结果分析
• 4.3 GPV VP3基因用于构建基因疫苗的可行性
• 5 小结
• 第四章 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其在真核细胞的表达
• 1 材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 毒株、细胞及鸭胚
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 T载体的酶切和VP3基因片段的纯化回收
• 2.2 真核表达载体pcDNA3.1（+）的酶切和线性化
• 2.3 VP3基因回收片段和线性化pcDNA3.1（+）的连接（亚克隆）
• 2.4 感受态细胞的制备
• 2.5 真核重组表达载体的转化
• 2.6 阳性重组真核表达质粒的小量抽提和鉴定
• 2.7 GPV病毒提纯及兔抗GPV多克隆抗体的制备
• 2.8 pcDNA-VP3转染COS-7真核细胞
• 2.9 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-VP3在真核细胞的瞬时表达
• 3 结果
• 3.1 VP3基因的亚克隆
• 3.2 兔抗GPV IgG的纯化结果
• 3.3 真核表达质粒在COS-7细胞上的瞬时表达
• 4 讨论
• 4.1 构建小鹅瘟基因疫苗的必要性
• 4.2 构建基因疫苗的一些影响因素
• 4.3 GPV VP3基因疫苗在真核细胞的表达
• 5 小结
• 第五章 串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3融合基因DNA疫苗的构建
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 重叠延伸引物的设计
• 2.2 碱裂解法小量抽提pMD18T-gIL2和pMD18T-VP3
• 2.3 gIL-2基因的PCR扩增
• 2.4 VP3基因的PCR扩增
• 2.5 gIL-2和VP3基因PCR产物的回收和纯化
• 2.6 gIL2-VP3融合基因的SOE PCR扩增
• 2.7 融合基因PCR产物的纯化和回收
• 2.8 克隆至pMD18T-Simple载体和转化受体菌
• 2.9 融合基因gIL2-VP3的亚克隆
• 2.10 融合基因真核表达载体的鉴定
• 2.11 融合蛋白的生物信息学分析
• 2.12 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞上的表达
• 2.13 pcDNA-gIL2-VP3表达蛋白的gIL-2生物学活性测定
• 3 结果
• 3.1 gIL2-Linker的初次PCR结果
• 3.2 GPV的Linker-VP3初次PCR结果
• 3.3 gIL2-VP3融合基因的PCR结果
• 3.4 融合基因的T载体克隆和测序结果
• 3.5 pcDNA-gIL2-VP3真核表达载体的构建结果
• 3.6 gIL2-VP3融合基因的生物信息学分析
• 3.7 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞中的表达
• 3.8 表达蛋白的gIL-2生物学活性测定
• 4 讨论
• 4.1 关于鹅白介素-2（gIL-2）的佐剂效应
• 4.2 关于重叠延伸PCR
• 4.3 融合基因gIL2-VP3的分子结构特点
• 4.4 gIL-2信号肽引导的分泌表达
• 5 小结
• 第六章 CpG序列嵌入串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗中的构建
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 CpG的合成及T载体克隆
• 2.2 pMD18 T-CpG的酶切和回收
• 2.3 pcDNA-gIL2-VP3的酶切和回收
• 2.4 CpG和线性pcDNA-gIL2-VP3的连接
• 2.5 感受态细胞的制备
• 2.6 连接产物的转化
• 2.7 pcDNA-gIL2-VP3/CpG重组质粒的筛选
• 2.8 pcDNA-gIL2-VP3/CpG真核表达质粒在真核细胞的表达
• 2.9 pcDNA-gIL2-VP3/CpG对鹅外周血淋巴细胞的免疫刺激作用
• 3 结果
• 3.1 pMD18 T-CpG的测序结果
• 3.2 pMD18T-CpG的酶切鉴定
• 3.3 pcDNA-gIL2-VP3/CpG的构建及其鉴定
• 3.4 间接免疫荧光抗体试验检测pcDNA-gIL2-VP3/CpG在真核细胞的表达
• 3.5 CpG序列对鹅外周血淋巴细胞的增殖效应
• 4 讨论
• 4.1 关于CpG ODN的设计和嵌入质粒的构建
• 4.2 CpG序列的免疫佐剂效应
• 5 小结
• 第七章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅细胞免疫的比较研究
• 1 材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 试验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 基因疫苗的大量制备
• 2.2 聚乙二醇法（PEG-8000）纯化基因疫苗质粒
• 2.3 雏鹅的分组免疫及血样采集
• 2.4 鹅外周血（PBMC）淋巴细胞增殖试验（MTT法）
• 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离
• 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养
• 2.4.3 样品检测及数据处理
• 3 结果
• 3.1 基因疫苗免疫动物后健康状况
• 3.2 鹅免疫GPV VP3基因疫苗后淋巴细胞增殖试验检测结果
• 3.3 pcDNA-VP3基因疫苗免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果
• 3.4 pcDNA-gIL2-VP3免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果
• 3.5 pcDNA-gIL2-VP2/CpG免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果
• 3.6 GPV VP3基因疫苗免疫鹅后外周淋巴血细胞增殖试验结果
• 4 讨论
• 4.1 细胞免疫对于防治感染性疾病的重要性
• 4.2 细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系
• 4.3 分子免疫佐剂对基因疫苗诱导的细胞免疫反应的影响
• 4.4 免疫途径、剂量对细胞免疫的影响
• 5 小结
• 第八章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅体液免疫的比较研究
• 1 材料
• 1.1 毒株、质粒及疫苗
• 1.2 试验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 鹅血清IgG的纯化
• 2.2 兔抗鹅辣根过氧化物（HRP）酶标抗体的制备
• 2.3 间接ELISA的操作方法
• 2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定
• 2.5 酶标抗体稀释度的选择
• 2.6 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清IgG水平的检测
• 50的测定'>2.7 GPV CHa弱毒株TCID₅₀的测定
• 2.8 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清中和抗体水平的检测
• 2.9 种鹅的分组免疫及所产蛋卵黄ELISA抗体和中和抗体的检测
• 2.10 免疫种鹅所产蛋孵出的小鹅攻毒保护试验
• 3 结果
• 3.1 兔抗鹅HRP酶标抗体的制备
• 3.2 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定
• 3.3 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定
• 3.4 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后的IgG动态变化结果
• 3.5 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-VP3后IgG动态变化
• 3.6 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗后IgG动态变化
• 3.7 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗后IgG动态变化
• 3.8 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后IgG动态变化结果
• 50的测定'>3.9 病毒TCID₅₀的测定
• 3.10 鹅基因免疫后血清中和抗体试验检测结果
• 3.11 母鹅卵黄抗体ELISA检测结果和中和抗体试验结果
• 3.12 雏鹅攻毒保护试验结果
• 4 讨论
• 4.1 ELISA标准方法的建立
• 4.2 关于GPV VP3基因疫苗诱导的体液免疫
• 4.3 免疫佐剂对体液免疫的影响
• 4.4 雏鹅攻毒保护试验
• 5 小结
• 第三部分 结论
• 第四部分 参考文献
• 第五部分 附件材料
• 附录一 主要溶液试剂的配制
• 附录二 雏鹅攻毒保护试验中发病鹅的主要临床症状和病变
• 附录三 测序报告
• 1.pMD18T-VP3测序结果
• 2.pMD18T-gIL2-VP3测序结果
• 3.pMD18T-CpG测序结果
• 致谢
• 作者简介