水稻钙结合小分子蛋白基因smCaBP的分离与鉴定

论文摘要

研究证明,C DPK、CaM/CML、CBL-CIPK等钙信号蛋白家族在植物钙信号转导过程中起重要作用,其少数成员的生化特征和基因功能研究的比较透彻。但是,只含有1个EF-hand的钙结合小分子蛋白基因（small molecule calcium binding protein gene, smCaB P）在植物逆境适应性中功能的研究还很少。目前,在水稻中只发现了一个受ABA和渗透胁迫诱导表达的钙结合小分子蛋白基因EFA27,我们将它命名为smCaBP1。本课题从水稻低温表达芯片和胁迫诱导表达中筛选出2个新的水稻钙结合小分子蛋白基因,我将它们命名为smCaBP2和 smCaBP3。我们比较了这3个钙结合小分子蛋白的分子结构和钙结合特性,研究了它们在非生物逆境中的诱导表达和功能。具体结果如下：1.蛋白结构分析表明,植物smCaBP均含有1个EF-hand motif,可分为二大类,smCaBP2（12.3kDa）和 smCaBP3（13.9kDa）,为第一大类。smCaBP1（27.1kDa）与它们的同源性分别为58%和40%,属于第二大类。在EF-hand loop中, smCaBP2与smCaBP3 比 smCaBP1多1个谷氨酰胺（E）或天冬氨酸（D）。2.体外钙结合测定表明,GST-smCaBPs分别与CaCl2, MgCl2以及CaCl2+MgCl2反应后,在Native-PAGE中除GST-smCaBPl外,对GST-smCaBP2和GST-smCaBP3与钙离子选择性结合后迁移率变小,镁离子对其影响不大。推测GST-smCaBP2和GST-smCaBP3在体外与钙离子结合后,构象改变。3. RT-PCR检测表明,smCaBP1在200 mmol/L NaCl和 20%PEG-6000处理下诱导表达。smCaBP2受40℃、200 mmol/L NaCl和 20%PEG-6000处理下诱导表达。smCaBP3在20%PEG-6000处理诱导表达。有趣的是,smCaBP1,2,3均受100μmmol/L ABA处理的强烈诱导表达。推测它们可能参与ABA的信号传导过程。4.潮霉素和PCR检测表明,tmCaBP1,2,3的T-DNA插入突变体均为杂合子,与野生型相比,内源基因表达水平不同程度地下降,其株高略矮,其生长发育正常。smCaBPl,2,3超表达转基因阳性植株的内源基因表达增强,生长发育正常。5.ABA敏感性检测表明,与野生型相比,ABA处理对smCaBP1和 smCaBP2超表达转基因植株幼芽的抑制更严重,根系的敏感性明显大于地上部。6.耐盐性和耐旱性鉴定表明,水培14d水稻幼苗在20%PEG-6000处理7d恢复7d后,smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株的存活率分别比对照中花11高36.65%和25.15%。水培14d水稻幼苗在200mmol/LNaCl处理4d恢复7d后,smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株的存活率分别比对照中花11高36.2%和2.93%。因此,smCaBP1可以提高水稻的耐盐性和耐旱性,smCaBP2仅仅提高水稻的耐旱性,对耐盐性影响不大。本文还讨论了水稻中smCaBP的发现、钙结合测定和基因功能鉴定,为今后的研究指明了方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 略词表（Abbreviations）
• 1 前言
• 1.1 钙在植物生长发育中的重要性
• 1.1.1 植物对钙的吸收和分布
• 1.1.2 植物中的钙信号
• 1.2 植物细胞内钙结合蛋白
• 1.2.1 按组成分类
• 1.2.2 EF-hand motif的构象
• 1.2.3 主要的钙靶蛋白
• 1.3 CaM和CML蛋白构象和功能研究
• 1.4 CDPK蛋白构象和功能研究
• 1.5 钙调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-like protein,CBL）
• 1.6 植物钙结合小分子蛋白功能的研究
• 1.6.1 植物钙结合小分子蛋白基因的起源
• 1.6.2 植物钙结合小分子蛋白功能的鉴定
• 1.7 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 水稻幼苗培养和逆境处理
• 2.2.2 水稻叶片总RNA的提取
• 2.2.3 CTAB法提取水稻DNA
• 2.2.4 smCaBPs基因超表达和原核表达引物的设计
• 2.2.5 PCR的条件
• 2.2.6 RT-PCR
• 2.2.7 PCR产物的加尾、回收产物连接T载体
• 2.2.8 感受态制备
• 2.2.9 连接产物转化
• 2.2.10 菌落PCR、质粒提取和测序
• 2.2.11 融合蛋白的诱导表达及检测
• 2.2.12 融合蛋白的纯化及浓度测定
• 2.2.13 钙离子结合特性分析
• 2.2.14 农杆菌介导的水稻愈伤组织转基因
• 2.2.15 潮霉素筛选纯合突变体和转基因植株
• 2.2.16 双引物法鉴定T-DNA纯合突变体
• 2.2.17 形态性状观察
• 3 结果和分析
• 3.1 3个水稻钙结合小分子蛋白基因smCaBPs的结构分析
• 3.1.1 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3基因的发现与命名
• 3.1.2 植物钙结合小分子蛋白的同源性分析
• 3.1.3 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3的EF-hand motif结构分析
• 3.2 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3蛋白的原核表达和生化活性分析
• 3.2.1 原核表达载体的构建
• 3.2.2 原核表达蛋白的诱导合成和纯化
• 3.2.3 smCaBPs在体外钙离子结合的检测
• 3.3 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3基因在胁迫下的诱导表达
• 3.4 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3基因功能的分析
• 3.4.1 超表达载体的构建
• 3.4.2 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3基因插入突变体的鉴定
• 3.4.3 smCaBP1、smCaBP2和smCaBP3超表达转基因阳性植株的鉴定
• 3.4.4 smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株对外源ABA的敏感性
• 3.4.5 smCaBP1和smCaBP2超表达转基因植株耐盐性和耐干旱性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 水稻中钙结合小分子蛋白基因的发现
• 4.2 水稻中钙结合小分子蛋白钙结合活性的分析
• 4.3 水稻中钙结合小分子蛋白基因功能的鉴定
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ 常用试剂的配方
• 附录Ⅱ 引物序列
• 附录Ⅲ 用于聚类分析的氨基酸序列
• 致谢