登革4型病毒基因组5’端SLB和cHP二级结构对复制和翻译的调控作用

论文摘要

登革病毒（DEN）为黄病毒属（Flavivirus）的重要成员,是人类登革热（DF）、登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）的病原体。DF和DHF是分布最广发病最多、危害较大的虫媒病毒性疾病。其发病率及病死率也呈逐年上升的趋势,但关于DF至DHF/DSS的发病机理迄今尚未阐明,这使登革疫苗和抗病毒药物研究举步维艰,因此加强对登革病毒复制和翻译调控分子机制研究具有重要意义。登革病毒基因组的5′和3′端存在多个保守的线性序列及二级结构,通过参与基因组环化及与病毒和宿主蛋白的相互作用来调控病毒基因组复制和翻译。其中5′端二级结构主要包括SLA、SLB和cHP,目前对SLA的研究较为深入,但对SLB和cHP研究报道较少,鉴于SLB和cHP在所有黄病毒中高度保守,其在病毒复制、翻译调控机制中可能具有重要作用,本研究以SLB和cHP二级结构为靶点,试图揭示其在病毒复制和翻译调控机制中的作用。获得的主要研究结果包括以下三个方面。一、登革4型病毒亚基因组复制子系统的构建及鉴定为构建含有报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子系统,我们首先利用定点诱变PCR方法构建prM-E基因缺失的登革4型病毒亚基因组复制子（DENRP）,然后利用CHYSEL（顺式水解酶元件cis-acting hydrolase element）技术分别将海肾萤光素酶（R. luc）和EGFP报告基因插入到DENRP缺失的结构基因区,构建含有R.luc和EGFP报告基因的复制子DEN-R.luc2A-RP和DEN-GFP2A-RP。同时还采用重叠PCR技术分别构建缺失NS5中依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）GDD关键基序的相关复制缺陷型复制子DEN-△GDD-RP、DEN-R.luc2A△GDD-RP和DEN-EGFP2A△GDD-RP,作为相关的对照。将构建的上述复制子分别线性化并体外转录成RNA后,将等量的上述RNA经电穿孔和脂质体法分别转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR和R.luc检测技术对复制子进行鉴定。结果表明, DENRP、DEN-R.luc2A-RP和DEN-EGFP2A-RP在BHK-21细胞中均可稳定表达,其中DEN-R.luc2A-RP在转染后3h和72h可形成两个稳定的信号峰,分别代表病毒早期翻译和RNA复制水平,且检测区间灵敏度较高,可用于定量检测复制子复制和翻译水平的改变;DEN-EGFP2A-RP在转染后30h可检测到GFP阳性信号,但阳性细胞比例低于5%,其仅适用于进行相关的定性研究;DENRP可分别稳定表达R.luc和EGFP报告基因,表明其载体性状较稳定,可探讨进一步将其改造为表达载体。此外,对电穿孔和脂质体法两种转染方法的比较结果表明,脂质体方法操作简便、更易于获得稳定转染,转染方法应首选脂质体法。本研究所购建的含有报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子系统在BHK-21细胞中均获得了稳定表达,上述复制子的成功构建为研究SLB和cHP在病毒复制和翻译调控机制中作用奠定了基础。二、登革4型病毒5′非编码区SLB茎环结构对病毒复制和翻译的调控作用为探讨5′非编码区SLB二级结构对病毒复制和翻译的影响。我们首先利用mfold软件对截取的登革4型病毒基因组5′端156nt二级结构进行预测,确定以SLB二级结构为靶点,以上述构建的含有海肾萤光素酶报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子体外复制模型为技术平台,通过重叠PCR构建SLB系列突变体: SLB1,缺失第82-87位核苷酸,使5′UAR部分环化序列缺失,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环第77位核苷酸引入突变（G/C）破坏其环状结构; SLB3,在第77-78位核苷酸引入突变（AG/GA）,该突变未破坏该次环结构。将阳性和阴性对照DEN-R.luc2A -RP和DEN-R.luc2A△GDD-RP及上述3个突变体分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR、R.luc报告基因和实时RT-PCR技术对突变体复制和翻译进行检测。结果表明, SLB1的复制和翻译效率均下降,该突变体可作为制备减毒活疫苗的候选靶标。SLB2的复制受到严重抑制,但对病毒翻译无显著影响;SLB3的复制和翻译均受到了严重抑制。这些结果表明SLB次环的核苷酸及其二级结构高度保守,在病毒复制中起重要作用。这为最终阐明SLB保守二级结构在病毒复制翻译调控机制中的作用奠定了基础。三、登革4型病毒基因组5′端cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用为研究登革4型病毒C基因N末端保守的cHP发卡结构对病毒复制和翻译的影响,我们以cHP发卡结构为靶点,在DEN-R.luc2A-RP基础上,通过重叠PCR方法构建cHP系列突变体（H1-H6）:H1完全缺失cHP二级结构,H2和H3均在顶环部位引入突变,目的是研究顶环核苷酸序列的改变对病毒复制和翻译的影响,H4、H5和H6通过对其茎部二级结构进行缺失、突变及回复突变,探讨该茎部结构的改变对病毒复制和翻译的影响。将阳性和阴性对照DEN-R.luc2A -RP和DEN-R.luc2A△GDD-RP及上述6个突变体分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR、R.luc报告基因和实时RT-PCR技术对突变体复制和翻译水平进行检测。RT-PCR和间接免疫荧光检测结果表明,上述各突变体均可在BHK-21细胞中复制并表达登革4型病毒特异蛋白,证明其均非致死性突变。在此基础上,进一步通过R.luc报告基因和实时定量RT-PCR方法分别定量检测各突变体转染后不同时间点萤光素活性和突变体mRNA拷贝数,实时监测各突变体复制和翻译水平的改变。结果表明,无论是在该发卡结构的顶环中引入突变,还是在茎部缺失突变破坏或恢复该结构,对病毒早期翻译并无显著影响,但病毒RNA复制均受到严重抑制。表明cHP发卡结构参与病毒复制的调控。此外,本研究所构建的6个cHP突变体均存在不同程度的复制缺陷,但其翻译水平并未显著下降,其在所有的检测点均可持续稳定复制。上述结果的获得为最终阐明登革4型病毒cHP保守二级结构在病毒复制翻译调控机制中的作用和登革新型减毒疫苗的研制奠定了基础。本研究成功构建了登革4型病毒亚基因组复制子系统,其中含有海肾萤光素酶报告基因的复制子在3h和72h获得的检测信号可区分病毒早期翻译及后期RNA复制。在此基础上,我们对SLB和cHP在病毒复制和翻译调控机制中的作用进行了系统研究。结果表明,SLB和cHP二级结构在黄病毒中高度保守,均参与了病毒复制和翻译调控,其中,H1-H6和SLB1突变使基因组复制水平显著下调,SLB2和SLB3突变基因组复制受到了完全抑制,但SLB2早期的翻译并未受到抑制。此外H1- H6及SLB1突变体均存在不同程度的复制水平下降,但仍可稳定复制并翻译病毒蛋白,有可能成为新的登革病毒减毒活疫苗候选株。上述研究结果为最终阐明SLB和cHP保守二级结构在病毒复制翻译调控机制中的作用奠定了基础。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 登革4型病毒亚基因组复制子系统的构建及鉴定
• 一、实验材料
• 二、方法
• 第二部分 登革4型病毒5′非编码区SLB二级结构对病毒复制和翻译的调控作用
• 一、 材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 第三部分 登革4型病毒cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用
• 一、 材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 总结
• 参考文献
• 博士期间发表的论文
• 个人简历
• 致谢