四种园林昆虫酚氧化酶基本酶学特性及效应物对其活性的抑制作用

论文摘要

酚氧化酶（Phenoloxidase,EC.1.14.18.1,简称PO）广泛存在于动物、植物和微生物等不同生物体内。该酶具有单酚酶（Monophenoloxidase,MPO）活性和二酚酶（Diphenoloxidase, DPO）活性,可催化单酚（Monphenols）羟化成二酚（如L-DOPA）,并把二酚再度氧化成醌。它是昆虫体内的一种重要酶类,在昆虫的变态发育和免疫系统中起着重要作用。由于酚氧化酶具有重要的理论意义和发展前景,大量的研究工作集中在此领域,筛选、设计、合成酚氧化酶抑制剂成为研究热点。本文以2种鳞翅目Lepidoptera昆虫舞毒蛾Lymantria dispar、淡剑袭夜蛾Sidemia depravata和2种鞘翅目Coleoptera昆虫核桃扁叶甲Gastrolina depressa、华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita四种园林昆虫酚氧化酶为试验对象,对其进行了部分纯化,并分别比较了同一目不同种类及异目昆虫酚氧化酶的基本酶学特性,初步探讨了几种金属离子与几种有机溶剂对这四种昆虫PO的影响,并在参考前人对农业害虫PO抑制剂以及对水果、蔬菜护色剂研究的基础上,选择了曲酸、槲皮素、4-十二烷基间苯二酚和4-己基间苯二酚作为效应物研究其对鳞翅目害虫——舞毒蛾幼虫酚氧化酶活性的抑制参数;并选择抗坏血酸和L-半胱氨酸对鳞翅目——淡剑袭夜蛾幼虫和鞘翅目——核桃扁叶甲成虫为酶源的酚氧化酶的抑制作用进行了测定,其中对高效抑制剂的抑制动力学进行了研究。结果表明:1.经不同饱和度硫酸铵分级沉淀,将舞毒蛾（Lymantria dispar）、核桃扁叶甲（Gastrolina depressa）、淡剑袭夜蛾（Sidemia depravata）和华北大黑鳃金龟（ Holotrichia oblita）酚氧化酶部分纯化。鳞翅目昆虫舞毒蛾幼虫和淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶的最大酶活力均存在于35%饱和度硫酸铵溶液沉淀中,两虫的最适pH值分别为6.5,7.0,其最适温度也不相同,分别为35℃和25℃。以邻苯二酚、焦性没食子酸和L-多巴作底物时,反应产物有吸收峰出现（特征吸收峰分别为410、334和465nm）,而以对苯二酚、间苯二酚作底物时未见明显吸收峰。L-多巴、邻苯二酚和焦性没食子酸与酶的Km值依次为3.19、10.74和19.26 mmol·L-1。以邻苯二酚和L-多巴作底物时,反应产物有吸收峰出现（特征吸收峰分别为410和475nm）,以对苯二酚、间苯二酚作底物时也未见明显吸收峰。以邻苯二酚和L-多巴为底物的淡剑袭夜蛾酚氧化酶酶促反应的米氏常数Km分别为1.44和37.49 mmol·L-1。鞘翅目昆虫核桃扁叶甲成虫和华北大黑鳃金龟成虫酚氧化酶的最大酶活力均存在于40%饱和度硫酸铵溶液沉淀中,其最适pH值分别为7.5、7.0,两虫最适温度相同均为40℃,以L-多巴和邻苯二酚为底物时,华北大黑鳃金龟和核桃扁叶甲酚氧化酶的Km值分别为3.02和61.25mmol·L-1,15.01和9.17 mmol·L-1。2.研究金属离子对四种昆虫酚氧化酶活力的影响,结果表明:K+和Na+对核桃扁叶甲成虫、淡剑袭夜蛾幼虫、华北大黑鳃金龟成虫PO的活性基本没有影响;但K+对舞毒蛾幼虫有轻微的抑制作用。Mg2+对舞毒蛾幼虫酚氧化酶有抑制作用;但对核桃扁叶甲成虫、淡剑袭夜蛾幼虫PO有激活作用;Mg2+在低浓度时对华北大黑鳃金龟成虫PO具有激活作用,高浓度时抑制。Ba2+能激活核桃扁叶甲成虫、淡剑袭夜蛾幼虫中的PO,但对华北大黑鳃金龟PO无显著的影响。Cu2+对舞毒蛾幼虫、淡剑袭夜蛾幼虫和华北大黑鳃金龟成虫PO的影响都是在低浓度时对其有激活作用,高浓度时表现为抑制作用作用。而Cu2+对核桃扁叶甲成虫酚氧化酶具有显著抑制作用。Zn2+对淡剑袭夜蛾幼虫PO有激活作用;但对核桃扁叶甲成虫PO有显著抑制作用;该离子在低浓度时对舞毒蛾幼虫和华北大黑鳃金龟成虫PO有激活作用,高浓度时表现为抑制作用作用。研究还发现Mn2+对淡剑袭夜蛾幼虫PO无显著的激活或抑制作用;但在低浓度时能激活华北大黑鳃金龟PO,高浓度又起抑制作用。3.研究有机溶剂对四种昆虫酚氧化酶活力的影响,结果表明:乙醚能显著的抑制淡剑袭夜蛾幼虫和华北大黑鳃金龟成虫PO的活性。甲醇对舞毒蛾幼虫、核桃扁叶甲成虫、淡剑袭夜蛾幼虫和华北大黑鳃金龟PO具有显著的抑制作用。乙醇和丙三醇能抑制核桃扁叶甲成虫和华北大黑鳃金龟成虫PO的活性,但是乙醇对淡剑袭夜蛾幼虫具有轻微的激活作用,丙酮对舞毒蛾幼虫和华北大黑鳃金龟成虫酚氧化酶有显著的抑制作用,但对淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶无显著的激活或抑制作用。4.研究效应物对四种昆虫酚氧化酶活力的抑制作用,结果表明:以邻苯二酚为底物时,槲皮素和4-十二烷基间苯二酚都能显著的抑制舞毒蛾幼虫酚氧化酶活力,对舞毒蛾幼虫酚氧化酶活力的抑制中浓度（IC50）分别为0.076 mmol·L-1和0.372 mmol·L-1,并且这两种抑制剂都是舞毒蛾幼虫酚氧化酶的竞争性抑制剂,其抑制常数Ki分别为31.71 mmol·L-1和0.192 mmol·L-1。研究4HR和曲酸对四种昆虫酚氧化酶的抑制动力学,结果表明:4HR对该虫的单酚酶和二酚酶活性均表现很强的抑制作用,其IC50分别为0.00041 mmol/L和0.00035 mmol/L。其中,4HR对单酚酶活力表达的迟滞时间有明显的延长效应,浓度为0.0002 mmol/L时可使单酚酶活力表达迟滞时间从181 s延长到253 s;而当浓度为0.0005 mmol/L时,其迟滞时间则延长至372 s。以邻苯二酚为底物时,4HR对二酚酶的抑制作用表现为典型的竞争型抑制类型,抑制常数KI为0.00015 mmol/L。曲酸对舞毒蛾的单酚酶和二酚酶活性均表现较强强的抑制作用,其IC50分别为0.06 mmol/L和0.92 mmol/L。曲酸对单酚酶活力表达的迟滞时间也有明显的延长效应,浓度为0.1 mmol/L时可使单酚酶活力表达迟滞时间从306 s延长到732 s ;而当浓度为0.15mmol/L时,其迟滞时间则延长至900 s。以邻苯二酚为底物时,曲酸对二酚酶的抑制作用表现为典型的竞争型抑制类型,抑制常数KI为0.51 mmol/L。以邻苯二酚为底物时,核桃扁叶甲成虫酚氧化酶对抗坏血酸不甚敏感,抗坏血酸只能抑制该酶大约27%的相对活性,并且抗坏血酸对该酶的抑制作用具有可逆效应;但淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶对抗坏血酸较为敏感,抗坏血酸对淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶活力抑制中浓度（IC50）为0.36 mmol·L-1,且该抑制剂是淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶的一种不可逆竞争性抑制剂,其抑制常数（Ki）为0.0768 mmol·L-1。以邻苯二酚为底物时,核桃扁叶甲成虫酚氧化酶对L-半胱氨酸非常敏感,L-半胱氨酸几乎可以完全抑制该酶的活性,并且该抑制剂是核桃扁叶甲成虫酚氧化酶的一种不可逆竞争性抑制剂,其抑制常数（Ki）为0.40 mmol·L-1。虽然淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶对L-半胱氨酸也较为敏感, L-半胱氨酸对淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶活力抑制中浓度（IC50）分别为0.0185 mmol·L-1,但淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶的一种可逆竞争性抑制剂,其抑制常数（Ki）为0.0742 mmol·L-1。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述与本课题目的意义
• 第一节 酚氧化酶研究概况
• 1.1.1 酚氧化酶的分布
• 1.1.2 酚氧化酶的生化特性
• 1.1.3 酚氧化酶活性中心的结构
• 1.1.4 酚氧化酶的催化氧化
• 1.1.5 酚氧化酶的功能
• 1.1.6 酚氧化酶的应用
• 1.1.7 酚氧化酶抑制剂的研究
• 第二节 昆虫酚氧化酶研究概况
• 1.2.1 昆虫酚氧化酶的种类
• 1.2.2 昆虫酚氧化酶的分布
• 1.2.3 昆虫酚氧化酶的功能
• 1.2.4 昆虫体内酚氧化酶的自我调节
• 1.2.5 昆虫酚氧化酶的分子生物学研究
• 1.2.6 昆虫酚氧化酶抑制剂的研究
• 第三节 本研究的内容和意义
• 1.3.1 本研究的基础与依据
• 1.3.2 本课题研究的内容
• 1.3.3 本课题研究的意义
• 第二章 异目园林昆虫酚氧化酶的基本酶学特性
• 第一节 鳞翅目园林昆虫舞毒蛾、淡剑袭夜蛾酚氧化酶的基本酶学特性
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 试虫和试剂
• 2.1.1.2 酚氧化酶液的制备
• 2.1.1.3 酶活性测定方法
• 2.1.1.4 PO的酶学性质研究
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.2.1 硫酸铵溶液饱和度的确定
• 2.1.2.2 最适pH 及其pH 稳定性的测定
• 2.1.2.3 最适温度及稳定性的测定
• 2.1.2.4 底物专一性测定
• 2.1.2.5 底物浓度对反应速率的影响
• 第二节 鞘翅目园林昆虫核桃扁叶甲和华北大黑鳃金龟酚氧化酶的基本酶学特性
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 试虫和试剂
• 2.2.1.2 酚氧化酶液的制备、酶活性测定方法、酶源蛋白质含量测定、PO的酶学性质研究
• 2.2.2 结果与分析
• 2.2.2.1 硫酸铵饱和度的确定
• 2.2.2.2 最适pH 的测定
• 2.2.2.3 最适温度的测定
• 2.2.2.4 底物专一性测定
• 2.2.2.5 底物浓度对反应速率的影响
• 第三节 小结与讨论
• 2.3.1 对不同目害虫酚氧化酶基本性质的分析
• 2.3.2 结论
• 2.3.3 讨论
• 第三章 金属离子及有机溶剂对四种园林昆虫酚氧化酶活性的影响
• 第一节 金属离子对四种园林昆虫酚氧化酶活性的影响
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.2 结果与分析
• 3.1.2.1 碱金属离子对四种园林昆虫酚氧化酶活性的影响
• 3.1.2.2 碱土金属离子对四种园林昆虫酚氧化酶活性的影响
• 3.1.2.3 过渡金属离子对四种园林昆虫酚氧化酶活性的影响
• 第二节 有机溶剂对四种园林昆虫酚氧化酶活性的影响
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.2.1 醇类有机溶剂对四种园林昆虫PO活性的影响
• 3.2.2.2 其它有机溶剂对三种园林昆虫PO活性的影响
• 第三节 结论与讨论
• 3.3.1 金属离子对四种园林昆虫PO 活性的影响
• 3.3.2 有机溶剂对四种园林昆虫PO 活性的影响
• 第四章 效应物对三种园林昆虫酚氧化酶的抑制作用及抑制动力学
• 第一节 抑制剂对舞毒蛾幼虫酚氧化酶的抑制作用及抑制动力学
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.1.1 试虫和试剂
• 4.1.1.2 酶活性测定方法
• 4.1.2 结果与分析
• 4.1.2.1 槲皮素对舞毒蛾幼虫酚氧化酶活力的抑制作用
• 4.1.2.2 4-十二烷基间苯二酚对舞毒蛾幼虫酚氧化酶的抑制作用
• 4.1.2.3 4-己基间苯二酚对舞毒蛾幼虫酚氧化酶活力的抑制作用
• 4.1.2.4 曲酸对舞毒蛾幼虫酚氧化酶活力的抑制作用
• 第二节 其它效应物对两种园林害虫酚氧化酶的抑制作用及抑制动力学
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.2 结果与分析
• 4.2.2.1抗坏血酸对核桃扁叶甲成虫和淡剑袭夜蛾幼虫酚氧化酶活力的抑制作用
• 4.2.2.2 L-半胱氨酸对核桃扁叶甲成虫和淡剑袭夜蛾酚氧化酶活力的抑制作用
• 第三节 讨论
• 参考文献
• 本论文的创新之处
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文