脂多糖对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞氯离子通道TMEM16A表达影响

论文摘要

目的：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratory distress syndrome，ARDS）是心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性缺氧性呼吸功能不全或衰竭。其临床表现主要为难治性低氧血症、非心源性肺水肿、肺动脉高压而体循环低血压。死亡率50%。急性肺损伤的病理生理特点之一是肺的渗透性水肿。已知肺泡上皮细胞在肺水清除过程中起到了重要的作用。目前认为肺泡Ⅰ型上皮细胞（Alveolarepithelial cells typeⅠ，ATⅠ）和Ⅱ型上皮细胞（Alveolar epithelial cellstypeⅡ，AT Ⅱ）在肺液清除中起着互相补充的作用，Ⅰ型上皮细胞在基本的肺液清除中发挥作用，Ⅱ型上皮细胞在增强清除方面发挥作用。而肺泡细胞膜表面的离子通道与肺水清除有着密切联系。虽然钠离子通道是肺水清除的主要动力，大量研究显示肺泡液体清除是包括钠、氯、水等多种离子通道形成的复杂转运网状体系。氯离子通道（chloride channels）在生物体内含量很丰富，但却一直被人们忽视，直到近年来才逐渐被关注。已有文献证明囊性纤维跨膜电导调节因子氯通道（CFTR）是对肺水清除存在一定作用的离子通道,如果缺失或出现功能障碍则可能致使肺泡内水肿液的清除阻碍。已有实验及临床证据证明，cAMP激动剂可加速肺水清除，而CFTR是这一过程所必需的。本实验选用TMEM16A为研究对象。TMEM16A基因是TMEM家族的一员，已经研究证实其在感觉神经元，上皮细胞，食管癌、膀胱癌及乳腺癌中均有表达。Caputo A等于2008年证实TMEM16A为钙激活的氯离子通道蛋白，近期有研究表明其与气道的粘液腺体分泌相关。目前肺泡Ⅱ型上皮细胞上TMEM16A表达及其与急性肺损伤时肺水清除的关系还未引起足够重视，本实验用脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）复制急性肺损伤时的肺泡Ⅱ型上皮细胞体外损伤模型，在独立环境下研究肺泡Ⅱ型上皮细胞上TMEM16A表达情况及其与急性肺损伤时肺水清除的关系。方法：选取清洁级健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠12只，体重220±10g。腹腔麻醉后，气管切开并插管，经右心房穿刺，分别经肺动脉及经气管插管灌洗肺脏。心肺整体迅速从胸腔取出体外，注入胰蛋白酶和胶原酶混合液37℃水浴消化20分钟。消化后剪碎肺组织,用细胞筛过滤，离心弃上清。细胞计数并调节细胞浓度。用大鼠IgG免疫粘附法纯化细胞。台盼兰测细胞活力,用电镜及AKP染色的方法鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞。用AKP染色的方法测定肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度。建立脂多糖对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞直接损伤模型，分组加入脂多糖。电镜观察比较正常及损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构，以确定急性肺损伤造模成功。用ELISA的方法检测各组细胞上清液中IL-1β表达水平。用Westren blot法检测各组ATⅡ上TMEM16A蛋白表达水平的差异。结果：1肺泡Ⅱ型上皮细胞计数，鉴定及活力测定：细胞纯化前每只大鼠可得细胞（4.50±1.12）×107个每只大鼠，用台盼蓝检测细胞活力为（92.08±5.18）％；细胞纯化后每只大鼠可得细胞（1.55±0.41）×107个，细胞活力为（90.17±5.10）％。AKP染色法检测纯化后细胞纯度为（79.17±3.07）％。电镜检测可证实为肺泡Ⅱ型上皮细胞并确定急性肺损伤造模成功。2用ELISA的方法检测脂多糖损伤细胞的上清液中IL-1β表达水平结果3空白对照组细胞上清液IL-1β浓度为（14.50±2.24）pg/mL，模型组IL-1β浓度（38.55±15.07）pg/mL。模型组IL-1β浓度高于空白对照组，P＜0.05。4用Western blot法检测各组ATⅡ上TMEM16A蛋白水平的差异结果。5蛋白印记结果，正常组（0.99±0.26）LPS组（1.00±0.11）之间无统计学差异P＞0.05,尚不能认为两组细胞中TMEM16A蛋白含量不同。结论：1本实验的原代大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离提纯方法可以得到足够纯度和活力的肺泡Ⅱ型上皮细胞，以进行对其体外干预造模的下一步实验。应用脂多糖成功复制体外干预下急性肺损伤模型。2脂多糖单独作用于体外培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞可直接损伤细胞，并可使细胞上清夜中IL-1β表达水平增加3脂多糖体外干预损伤组肺泡Ⅱ型上皮细胞与正常组肺泡Ⅱ型上皮细胞中TMEM16A蛋白表达差别无统计学意义。可能由于脂多糖造成的体外肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤不能使TMEM16A表达受到明显影响；或者此蛋白表达水平时相性需要进一步探讨；也不排除与实验条件不成熟有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 不同病因所致急性肺损伤过程中离子通道作用
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历