大鼠小体积肝移植术后早期缺血再灌注损伤机制及腺病毒介导心肌营养素-1转染对其保护的实验研究

论文摘要

第一部分大鼠小体积肝移植模型的建立及其早期缺血再灌注损伤特点及机制的初步研究目的建立稳定可靠的大鼠小体积肝移植模型,比较小体积和全肝移植术后早期缺血再灌注损伤程度并初步探讨其可能的损伤机制,为探寻小体积肝移植新的治疗策略提供理论和实验依据。方法健康雄性Lewis大鼠,随机分为三组:Ⅰ组sham组Ⅱ组100%肝移植组Ⅲ组40%小体积肝移植组。以Kamada的“二袖套法”非动脉化大鼠原位肝移植模型为基础,经过前期的熟练训练,采用体外肝叶切除的方法,以中叶作为供肝,建立理想的40%小体积肝移植模型。观察各组术后生存率和术后早期肝功能（AST和ALT）的变化;观察各组术后6小时肝脏光镜和电镜下组织学变化;酶促反应法测定各组术后6小时肝组织丙二醛（MDA）含量;酶联免疫吸附方法（ELISA）检测各组术后6小时肝组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平;检测三组术后6小时肝组织中髓性过氧化物酶（MPO）活性以反映肝组织中中性粒细胞浸润情况;TUNEL法检测三组肝术后6小时肝细胞凋亡情况。结果1.与全肝移植组相比,小体积肝移植组术后生存率明显下降（pp＜0.05）,小体积肝移植组7天生存率为33.3%（4/12）,全肝移植组和假手术组大鼠术后7天生存率分别为83.3%（10/12）和100%（10/10）。2.大鼠小体积肝移植术后血清AST和ALT水平明显增高,术后早期肝功能损害严重。与全肝移植相比,小体积肝移植组术后早期2、6和24小时血清AST和ALT水平增高更加显著（p＜0.05）。3.小体积肝移植术后6小时表现为肝小叶结构破坏、明显的肝细胞空泡样变性,局灶性肝细胞坏死。电镜下观察发现线粒体严重肿胀,肝窦内皮细胞间隙扩大,部分内皮细胞脱落,微绒毛减少或消失。与小肝移植组相比,全肝移植组肝组织光镜和电镜下损伤表现相对轻微。4.小体积肝移植术后6小时肝组织MDA含量（1.83±0.32）较全肝移植组（1.19±0.23）明显增加（p＜0.01）。5.小体积和全肝移植术后6小时TNF-α水平和MPO含量明显高于假手术组,且小肝移植组较全肝移植组增高更加明显。40%小肝组VS全肝组,TNF-α（7.91±1.07 vs 4.56±0.73 p＜0.01）;MPO（6.79±0.74 Vs 4.15±0.62 p＜0.01）。6.小体积肝移植术后6小时肝细胞凋亡指数（20.4±4.3）较全肝移植组（11.2±2.1）明显增加（p＜0.05）。结论建立了稳定可靠的大鼠小体积肝移植模型,为后续的实验研究奠定了基础。初步观察了小体积肝移植早期再灌注损伤的特点,发现小体积肝移植大鼠术后早期表现为较全肝移植更为严重的再灌注损伤。严重的氧化应激、加重的急性炎症反应和肝细胞凋亡是小体积肝移植物早期损伤加重的重要原因。第二部分:心肌营养素-1重组腺病毒载体的构建及鉴定、病毒的生产、扩增和纯化目的构建含小鼠CT-1基因的重组腺病毒载体pAd-CT-1,经鉴定成功后,293细胞包装同源重组产生腺病毒液。方法将编码小鼠CT-1cDNA基因通过PGEX4T-3-CT-1质粒SalI-NotI酶切位点克隆后再经相同的酶切位点亚克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒载体,建立含mCT-1基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-CT-1。pAdTrack-CMV穿梭载体在（CMV）启动子调控下编码EGFP作为转染的标记。这个质粒通过PmeI限制性消化成线性并与pAdEasy-1共转入E.coli BJ5183细胞。重组子可以通过对卡那霉素耐药性筛选并通过限制性酶切分析确认。线性化的重组质粒应用Lipofectamine转染试剂在细胞株AD293内包装成病毒体。转染和病毒生产通过GFP的表达监测。采用CsC1密度梯度超离心法纯化捕?用空斑形成试验进行病毒滴度测定。结果经酶切、PCR及测序鉴定后,显示构建的腺病毒载体中含有mCT-1基因;目的基因片段结果与Gene bank中mCT-1 cDNA序列一致。经293细胞包装产生的病毒Ad-CT-1,纯化后滴度可以达到1012pfu/ml。结论采用DNA重组技术,成功构建重组腺病毒载体pAd-CT-1,重组腺病毒液滴度高,为下一部的体内实验研究奠定了物质基础。第三部分腺病毒介导心肌营养素-1转染对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤保护及机制的实验研究目的探讨供肝腺病毒心肌营养素-1基因转染对大鼠小体积肝移植术后早期缺血再灌注损伤是否有保护作用及其可能的相关机制。方法采用健康雄性Lewis大鼠,体重为250-320g,采用随机化分组,实验分为三组:（ⅰ）AdCT-1治疗组（ⅱ）AdEGFP对照组（ⅲ）生理盐水对照组。供体大鼠静脉预输注3×109pfuAdCT-1病毒液,对照组则分别输注相同体积的生理盐水或3×109 pfuAdEGFP（以上均定容至1mL）。4天后处死供体大鼠,获取供肝,参照第一部分建立40%小体积肝移植模型,Westernblot检测和冰冻切片观察EGFP表达证实移植物中是否有外源性CT-1过表达;术后采血检测2、6、24小时血清AST和ALT水平变化;观察移植术后受体大鼠生存情况;光镜和电镜下观察术后6和24小时肝脏组织形态学变化;TUNEL法检测肝组织中细胞凋亡水平;Westernblot检测术后生存信号通道蛋白（Akt和磷酸化Akt;ERK和磷酸化ERK;Stat-3和磷酸化Stat-3）和凋亡相关蛋白（bcl-2和cleaved caspase-3）表达情况。结果1.供肝AdCT-1基因预转染能明显提高移植肝中外源性CT-1的表达。2.AdCT-1基因预处理能明显改善小体积肝移植术后肝脏功能,提高移植物生存率。生理盐水和AdEGFP对照组术后7天生存率分别为33.3%（5/15）和40%（6/15）,而AdCT-1治疗组大鼠的生存率为73.3%（11/15）（p＜0.05）;AdCT-1治疗组大鼠术后2、6和24小时的血清AST和ALT水平较生理盐水和AdEGFP对照组明显降低（p＜0.05 or＜0.01）。生理盐水和AdEGFP对照组术后生存率和肝功能变化无统计学差异。3.组织学分析:HE染色显示:移植术后6小时,AdEGFP和生理盐水对照组肝细胞明显空泡样变性伴局部坏死,肝小叶结构破坏;24小时后,肝细胞变性、坏死更加明显;门静脉周围水肿、充血,小叶结构破坏更加严重。与AdEGFP和生理盐水对照组相比,AdCT-1组变性和坏死明显减轻。肝小叶结构完整。电镜结果显示:移植术后6小时AdEGFP和生理盐水对照组肝组织线粒体明显肿胀,微绒毛减少或消失,肝窦内皮细胞间隙不规则扩大。术后24小时上述改变更加明显,部分肝窦内皮细胞脱落、塌陷。而在AdCT-1组肝组织学结构得到明显的改善,线粒体轻度肿胀,肝窦内皮细胞较完整,有较多的微绒毛。4.TUNEL结果显示:AdCT-1组术后6小时和24小时移植肝组织中肝脏细胞凋亡指数明显低于AdEGFP和生理盐水对照组（p＜0.01）,AdEGFP和生理盐水对照组间差异无统计学意义。5.Westernblot检测显示:AdCT-1治疗组、生理盐水和AdEGFP对照组再灌注6和24小时移植肝组织中总Akt、ERK和Stat-3水平无明显差异,而磷酸化Akt、ERK和Stat-3水平在AdCT-1治疗组移植肝中显著上调。6.Westernblot检测结果亦显示:与生理盐水和AdEGFP对照组相比,AdCT-1治疗组再灌注6和24小时肝组织中抗凋亡蛋白bcl-2水平明显上调,而促凋亡蛋白cleaved caspase-3水平显著下调。结论供肝腺病毒心肌营养素-1基因转染对小体积肝移植早期缺血再灌注损伤有明显的保护作用,能够显著改善移植物早期肝功能、保护肝组织学结构,提高受体生存率。其保护作用可能部分因为CT-1激活术后肝组织中生存信号通道、增强凋亡抑制蛋白bcl-2的表达,抑制凋亡促进蛋白cleaved caspase-3的表达,从而减少细胞凋亡,减轻大鼠小肝移植术后早期缺血再灌注损伤。

论文目录

• 一、缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、第一部分:大鼠小体积肝移植模型的建立及其早期缺血再灌注损伤特点及机制的初步研究
• 前言
• （一）材料和方法
• （二）结果
• （三）讨论
• （四）小结
• 参考文献
• 五、第二部分:心肌营养素-1重组腺病毒载体的构建及鉴定、病毒的生产、扩增和纯化
• 前言
• （一）材料和方法
• （二）结果
• （三）讨论
• （四）小结
• 参考文献
• 六、第三部分:腺病毒介导心肌营养素-1转染对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤保护及机制的实验研究
• 前言
• （一）材料和方法
• （二）结果
• （三）讨论
• （四）小结
• 参考文献
• 七、致谢
• 八、文献综述和参考文献
• 综述:小肝综合征发生机制及其预防策略的研究进展
• 参考文献