论文摘要
上世纪80年代,基于经典的固相合成技术演化而来的DNA自动合成仪的诞生,突破了DNA化学合成的瓶颈,使得人们可以相当自由地设计各种类型的核酸分子探针,广泛地应用于生物学、医学等领域。但在后基因组学和蛋白质组学时代,人们不断对核酸分子探针在灵敏度、稳定性、分子识别与信号转换方式等多方面提出更高的要求,以发展新的分子生物学研究方法,这使得核酸分子探针的设计合成显得更为重要。本论文通过搭建核酸合成平台,开展了新型分子信标核酸分子探针的合成与性能研究,主要包括了以下三个方面的工作:（1）核酸合成平台的搭建基于DNA合成仪和液相色谱技术,合成纯化了普通DNA引物（cDNA）、常规分子信标（DNA-MB）以及超淬灭分子信标（SQ-MB）,利用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对纯化产物进行了分析,结果表明所得到的纯化产物均为目标分子。与cDNA杂交的结果表明,超淬灭分子信标的信背比达到40倍,比常规分子信标高出4倍。说明我们已经掌握了普通DNA引物以及染料标记的DNA探针的合成与纯化技术。（2）锁核酸分子信标的合成与性能考察为了实现活细胞内mRNA的监测,需要杂交速度快、灵敏度高、抗酶切能力强、选择性好的核酸分子探针。我们合成了一种茎部具有三对配对碱基的锁核酸分子信标（LNA-MB）,其与cDNA杂交反应速度快,5分钟即可达到平衡。与常规分子信标相比,该锁核酸分子信标抗酶切能力显著增强,热稳定性有了明显提高。（3）锁核酸分子信标与共臂cDNA杂交性能的考察有研究工作表明分子信标与共臂cDNA（shared-stem cDNA）杂交能够提高其灵敏度。因此我们考察了锁核酸分子信标与共臂cDNA的杂交性能。结果表明:与cDNA相比,共臂cDNA与锁核酸分子信标杂交的灵敏度更高,信背比达到200倍,线性范围为20 pmol·L-1– 20 nmol·L-1,检测限为9.8 pmol·L-1,且具有较好的选择性,杂交反应前20 s内的荧光初速度是错配DNA的5倍。该锁核酸分子信标所具有的高灵敏、高稳定性能有望实现对活细胞mRNA的高灵敏检测。