单克隆抗体亲和填料的制备及其在血浆高丰度蛋白分离中的研究

论文摘要

血浆中存在约上万种蛋白质,浓度从pg/mL到mg/mL,在血浆蛋白质组学研究中低丰度蛋白的检测常被高丰度蛋白干扰。因此,有必要对血浆样品进行预分离。预分离的目标是去除高丰度蛋白或直接富集低丰度蛋白。去除高丰度蛋白的方法有密度梯度离心、化学沉淀、膜截留、配体吸附（染料、抗体、多肽等）等。直接富集低丰度蛋白的方法有凝集素富集糖蛋白、金属表面吸附磷酸化蛋白、疏水微球吸附多肽或小分子蛋白等。血浆蛋白质组学研究目前常用高丰度蛋白去除后的样品进行。国外采取多克隆抗体（IgG,IgY）制备的亲和填料进行预分离。经一系列评价后发现具有很高的结合特异性,但也存在一定缺点如各操作系统间不兼容,有非特异吸附,抗体失活速率不均一等。目前未见国内有制备血浆高丰度蛋白质去除填料的相关研究报导,这与国内快速发展的蛋白质组学研究不相称。高丰度蛋白在样品中含量高,需高载量的亲和填料才能实现较理想的分离。抗体分子共价固定常用CNBr活化的琼脂糖法,但如果是抗体Fab段氨基而不是Fc段氨基与填料CNBr基团反应,就会因空间阻碍而失去一定的结合能力,不同抗体的Fab段氨基活性与Fc段氨基活性不同,因此抗体结合活性与这两区域的氨基活性比有关。利用抗体的Fc段糖基可实现定向固定,糖基氧化为醛基后与载体上氨基连接,但该方法在实际反应过程中会发生自偶联现象,即抗体分子间的氨基和醛基形成多聚体,使抗体结合活性下降,且单克隆抗体的糖基含量不同,固定效率也不同。以Prein G/A吸附抗体,然后用DMP（Dimethylpimelinediimidate chloride,庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐）使之与Protein G/A蛋白共价交联,使抗体定向固定在ProteinG/A,反应条件较温和。亲和填料在高丰度蛋白去除过程中存在非特异吸附蛋白的现象,主要是样品与容器表面,样品与支持填料,样品中蛋白与蛋白相互作用。不同亲和填料、色谱系统和样品处理所表现的非特异吸附各不相同,因此研究者提出“分离”而非“去除”的高丰度蛋白分离策略。因此鉴定每种亲和填料及其操作系统的非特异吸附蛋白群是后续蛋白质组研究的必要数据。相比于多克隆抗体,单克隆抗体技术成熟可靠,易大量制备和质量控制,与抗原的特定表位结合,具有有更可靠的吸附蛋白重复性。研究目的及意义:1)进行抗体固定方法的比较,选择有效的抗体固定方法。2)筛选合适的单抗,使填料具有最大的吸附量和反复吸附-洗脱能力。3)鉴定该单克隆抗体制备的亲和填料吸附蛋白,为后续血浆蛋白质组学研究提供数据。材料和方法:1)参考CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare,USA）、CarboLinkTM Coupling Gel（PIERCE Cat 20391）和POROS（?） 20XL MediaImmobilizing Antibody for Perfusion Immunoassays技术手册,用1mg抗白蛋白抗体固定于6mL胶（50%体积）,电泳检测抗体吸附能力。2)14株抗白蛋白单克隆抗体和15株抗球蛋白抗体用Protein G/A-mAb法固定（1mg抗体:0.6mL胶）,制备好的胶放入SpinX Tube中,加入15μL人血浆,孵育30分钟后3000g离心1分钟,收集流穿液1;加入0.1M PBS 300μL,混匀1分钟,3000g离心1分钟,收集流穿液2:重复3次;加入0.1M Gly-HCI pH2.5洗脱,收集洗脱液。合并流穿液1-4组份为分离高丰度蛋白后的血浆样品。SDS-PAGE分析实验结果。4)用0.2mg,0.5mg,1mg,5mg白蛋白和球蛋白对固定的2种白蛋白、4种球蛋白抗体载量进行测试。5)洗脱样品经双向电泳后进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定,每个点选3-6个母离子峰进行二级质谱分析,经Mascot检索后确定蛋白质。结果:1)Protein G/A-mAb法固定有效抗体最多。2)白蛋白,球蛋白单克隆抗体进行筛选后显示抗白蛋白抗体HPSIIB002、HPSIIB007;抗球蛋白抗体HPSIA010、HPSIA020、HPSIA025、HPSIIB011有良好的吸附-洗脱行为:实验结果显示400μL（1mg白蛋白单体、0.333mg球蛋白单抗）胶能分离10μL血浆中的白蛋白;处理后的血浆样品在SDS-PAGE和2-DE实验中能明显消除高丰度蛋白带来的影响;重复使用十次后结合能力无明显降低,但免疫印迹实验显示高丰度蛋白碎片在流穿液中增加;3)HPSIIB007白蛋白抗体和HPSIA010球蛋白抗体具有较高载量,最高结合摩尔比例分别为1:1.5和1:05左右。4)对非特异的吸附的蛋白进行了2-DE,MALDI-TOF/TOF鉴定,检测的110个点中,89个为白蛋白,球蛋白及其碎片,占80.9%。未检出7个点,检出率为93.6%。表明存在与填料非特异吸附,确定的吸附蛋白为:抗胰蛋白酶,Vitamin D结合蛋白,CD5抗原相似蛋白,纤维蛋白原,keratin 10,前脂蛋白,Transthyrentin,脂蛋白A-1,补体C3,转铁蛋白。结论:筛选出2株白蛋白单克隆抗体和4株球蛋白抗体适合亲和填料的吸附-洗脱操作;确定了Protein G/A-mAb法固定有效抗体最多;测试了亲和填料的载量和十次吸附-洗脱去除实验,吸附载量无明显下降,可适合多次重复操作;确定了该填料和操作平台下的非特异吸附蛋白图谱,为血浆蛋白质组研究提供必要数据。本研究用单克隆抗体实现了高丰度蛋白的去除填料的研发,操作方便,不需复杂色谱设备,为血浆蛋白学研究提供了有效的平台。该亲和填料已在本校中医系的血浆蛋白质组研究中得到应用。该技术平台可用于开发其它样品如唾液、脑脊液、尿液中的高丰度蛋白去除亲和填料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 抗体的筛选和固定
• 1.1 材料和方法
• 1.2 实验结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第二章 高丰度蛋白（白蛋白/球蛋白）的去除填料研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间所获成果
• 致谢