论文摘要
癌症依然是威胁人类健康的重大疾病,以往对癌发生发展的研究主要以癌基因与抑癌基因为中心的思路展开,但近年来,越来越多的证据表明,癌—基质交互作用影响着癌发生发展的多个关键步骤。因此,对癌—基质交互作用的研究是目前恶性肿瘤研究领域的前沿和热点,不仅对深入理解癌发生发展的机制具有重要的理论意义,而且可为新型癌标志物及治疗性药靶分子的发现提供现实依据。HAb18G/CD147是我室鉴定的新型肿瘤药靶分子,是CD147家族成员,属于免疫球蛋白超家族类粘附分子。在多种癌中高表达,而在正常组织不表达或极低表达。其表达可作为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者手术治疗后预后的独立预测因子;靶向该分子的放射免疫治疗剂,我室研制的国家一类新药LICARTIN,可显著抑制HCC临床进展、抑制晚期HCC患者肝移植术后的肿瘤复发转移率,并显著延长患者生存期。初步研究表明,肝癌细胞HAb18G/CD147分子可诱导成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）,促进肿瘤侵袭。但其抗体对该靶点的封闭作用尚不清楚,该靶点在癌—基质交互作用中的功能机制亦不明确。本研究旨在阐明HAb18G/CD147分子药靶特异性单抗HAb18抑制肿瘤侵袭的功能作用,及该靶点在促进成纤维细胞向癌—基质交互作用中主要的基质细胞类型——癌相关成纤维细胞转化中的作用,并初步探讨该药靶分子在参与癌—基质交互作用,促进肿瘤细胞迁移运动中的功能意义。实验分为三部分:第一部分HAb18单抗靶向封闭肝癌细胞HAb18G/CD147分子的功能作用抗体竞争结合实验显示,HAb18单抗可以有效结合HCC细胞上的HAb18G/CD147分子,以该单抗处理HCC细胞可得到与采用小干涉RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默HAb18G/CD147在HCC细胞中的表达类似的抑制效果。明胶酶谱法及人工重组基底膜侵袭小室实验显示,采用两种处理下调两株HCC细胞（FHCC-98及MHCC97-H细胞）中HAb18G/CD147分子的表达,可显著抑制HCC细胞MMPs的分泌及细胞的侵袭潜能（P < 0.01）;在HCC细胞与成纤维细胞的共培养体系中,细胞侵袭力较HCC细胞单培养明显增强;而下调HCC细胞中HAb18G/CD147分子的表达可显著抑制共培养体系中MMPs的分泌及细胞的侵袭潜能（P < 0.01）;进一步采用RNA干涉共沉默HCC细胞和/或成纤维细胞中两种主要的明胶酶MMP-2和MMP-9,发现无论是沉默HCC细胞中还是成纤维细胞中的MMPs,均会显著抑制HCC细胞与成纤维细胞共培养体系中细胞的侵袭潜能（P < 0.01）,但抑制成纤维细胞的MMPs较仅沉默HCC细胞中的MMPs对细胞侵袭力的影响更为显著（P < 0.01）;而沉默HCC细胞中HAb18G/CD147分子与共沉默HCC细胞及成纤维细胞中MMPs表达对共培养体系中细胞侵袭力的影响作用相当;以上结果提示HCC细胞相关HAb18G/CD147分子可以通过调节HCC细胞自身及其周围成纤维细胞MMPs的分泌,影响HCC细胞侵袭潜能,而其对成纤维细胞MMPs分泌的调节作用在HCC侵袭中发挥更为重要的作用,HAb18单抗可有效结合HCC细胞上的HAb18G/CD147分子并有效封闭该分子在肝癌侵袭转移中的功能。第二部分HAb18G/CD147分子“活化”基质成纤维细胞的实验研究α-SMA是目前较为认可的癌相关成纤维细胞的标志,明胶酶谱实验及Western-blot实验显示,HCC细胞与成纤维细胞共培养可增强共培养体系中MMPs的分泌及α-SMA的表达;而采用RNA干涉沉默HCC细胞中的HAb18G/CD147分子,可明显减少共培养体系中α-SMA的表达,提示HAb18G/CD147分子可能参与HCC细胞与成纤维细胞相互作用中诱导α-SMA表达,“活化”成纤维细胞的作用。采用重组HAb18G/CD147分子胞外全长片段rEP刺激成纤维细胞,明胶酶谱实验及Western-blot实验显示,其可诱导MMPs分泌水平上调,也可诱导成纤维细胞中α-SMA及HAb18G/CD147分子自身的表达;细胞免疫荧光实验结果显示,HCC细胞与成纤维细胞的共培养体系中,成纤维细胞表面HAb18G/CD147分子荧光强度较单培养时明显增强,rEP刺激成纤维细胞也可诱导细胞中HAb18G/CD147分子及α-SMA荧光强度增加,成纤维细胞形态呈收缩变化,提示HAb18G/CD147分子可能参与HCC细胞与成纤维细胞相互作用中诱导成纤维细胞α-SMA表达,促进成纤维细胞向具有肌成纤维细胞特点的癌旁成纤维细胞转化的作用,其在成纤维细胞中的正反馈调节用可能在这一功能中发挥作用。第三部分HAb18G/CD147分子参与肿瘤细胞迁移运动的初步探讨细胞迁移实验显示,采用RNA干涉法沉默HAb18G/CD147分子在HCC细胞中的表达或用其特异性单抗HAb18处理HCC细胞均可显著抑制细胞在Matrigel包被平面上的迁移速度（P < 0.05）;同样的处理也可显著抑制HCC细胞对Matrigel的粘附能力（P < 0.05）,提示HAb18G/CD147分子可参与HCC细胞与ECM或基底膜的粘附作用并参与细胞迁移运动;细胞免疫荧光实验显示,在伪足形成刺激剂TPA的诱导下,该分子可与F-肌动蛋白共定位于细胞的伪足,在CyD诱导的细胞骨架破坏情况下,该分子依然显示与F-肌动蛋白的共定位;免疫共沉淀实验显示该分子可与肌动蛋白共沉淀,提示该分子可能通过与细胞骨架蛋白的相互作用,参与细胞伪足的形成;细胞免疫荧光实验也显示,HAb18G/CD147分子与细胞迁移运动的关键调节因子膜型基质金属蛋白酶1（membrane type 1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP）存在细胞水平的共定位,且免疫共沉淀实验显示两者可能存在着相互作用关系。以上结果提示,HAb18G/CD147分子可能是HCC细胞迁移运动过程中联系ECM与细胞骨架蛋白的粘附分子,其可参与细胞与ECM的粘附及细胞伪足的形成,另外,其与MT1-MMP潜在的相互作用可能在细胞迁移中发挥一定作用。以上结果提示,HAb18G/CD147分子是参与癌—基质交互作用的重要分子。癌相关HAb18G/CD147分子对基质成纤维细胞分泌MMPs的调节在促进HCC细胞侵袭潜能的功能中发挥较其对HCC细胞自身MMPs分泌的调节更为重要的作用,其特异性单抗HAb18可有效封闭这一功能作用。本研究首次提出癌相关HAb18G/CD147分子可能参与肝癌细胞与基质成纤维细胞相互作用中对成纤维细胞的“活化”作用。并首次提出HCC细胞表面HAb18G/CD147分子参与肝癌细胞对ECM粘附、与肌动蛋白相互作用参与细胞伪足形成及其在HCC细胞迁移运动中的作用。为进一步阐明HAb18G/CD147分子这一肿瘤新靶点在癌—基质交互作用中的功能奠定基础,也为该抗肿瘤药靶分子的进一步应用提出新的思路。
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