论文摘要
目的：肺癌转移相关蛋白1（lung cancer metastasis related protein 1，LCMR1）的编码基因是我们实验室采用mRNA差异显示技术克隆到的新基因（GenBank ID：AY148462），目前功能不明确，为了研究该基因的功能，我们采用酵母双杂交系统从预转化人肝文库筛选LCMR1的相互作用蛋白，为进一步研究该基因的功能提供线索。方法：（1）PCR扩增pGEX-5T-LCMR1载体中的LCMR1编码区序列，通过引入EcoRI和PstI内切酶位点，将LCMR1编码区克隆到酵母双杂交系统中的pGBKT7载体，得到诱饵质粒pGBKT7-LCMR1，转化酵母菌AH109后，检测BD-LMCR1融合蛋白的表达、LCMR1蛋白的转录激活活性及对宿主菌AH109的毒性；（2）转化了诱饵质粒pGBKT7-LCMR1的酵母菌AH109与转化了人肝文库质粒的酵母菌Y187进行交配培养，利用营养缺陷型培养基，初步筛选阳性克隆；（3）重复检测报告基因的表达和去除阳性克隆中多余的质粒；（4）提取阳性克隆中的质粒DNA，用PCR和酶切的方法减少重复克隆，然后转化大肠杆菌DH5α，利用含氨苄青霉素的LB培养基筛选AD文库质粒转化子，提取AD文库质粒；（5）将pGBKT7-LCMR1质粒和AD文库质粒共转化酵母菌AH109，转化混合物铺板于营养缺陷培养基，再次验证其相互作用；（6）阳性克隆中AD文库质粒测序及生物信息学分析。结果：（1）PCR和测序鉴定pGBKT7-LCMR1载体构建成功，转化AH109，BD-LCMR1融合蛋白成功表达，LCMR1蛋白无转录激活活性和宿主毒性；（2）通过文库筛选得到72个阳性克隆；（3）经报告基因激活检测、多余质粒去除剩余57个克隆；（4）经酶切归类获得30阳性克隆；（5）共转化再次验证相互作用后仍为阳性的克隆有14个，经测序和信息学分析，其中非编码序列7个，编码序列7个，这7个编码序列分别是RPL29、RPS15a、HAMP、补体C3、ND4L、ND1和细胞色素P450。结论：（1）成功构建酵母双杂交系统所需的无转录激活活性、且对酵母菌无毒性的诱饵质粒PGBKT7-LCMR1；（2）通过酵母双杂交系统筛选预转化人肝文库获得了LCMR1蛋白的相互作用蛋白RPL29、RPS15a、HAMP、补体C3、ND4L、ND1和细胞色素P450，为下一步研究的开展打下坚实的基础；（3）LCMR1不仅与肺癌转移相关，很可能还通过与上述蛋白发生相互作用，参与调节了免疫、代谢、蛋白翻译合成等细胞最基本的生命活动。
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标签：肺癌转移相关蛋白论文; 蛋白质相互作用论文; 酵母双杂交论文; 文库论文;