洋地黄毒苷的微生物羟基化作用研究

论文摘要

洋地黄强心苷类药物是治疗充血性心力衰竭（心衰）的主要药物之一,同时还具有治疗室上性心律失常、心绞痛及抗肿瘤的作用。但是,洋地黄强心苷类药物存在排泄缓慢、易于蓄积中毒,而且治疗量和中毒量接近（治疗量约为中毒量的60%）的缺点。因此,本实验通过对强心苷类药物洋地黄毒苷进行微生物转化,希望得到一种速效、高效、低毒的强心苷类新药物。本实验选用新月弯孢霉（Curvularia lunata）KA-91、蓝色梨头霉（Absidia coerulea）AC307、雷斯青霉（Penicillium raistrickii） ATCC10490三株菌进行转化实验。通过薄层色谱法分析转化结果。经实验得知,新月弯孢霉KA-91转化洋地黄毒苷得到2个产物,即产物Ⅰ和产物Ⅱ,产物Ⅰ的转化率为27.3%,产物Ⅱ的转化率为4.6%;蓝色梨头霉AC307转化洋地黄毒苷得到1个产物,即产物Ⅲ,转化率为5.8%;雷斯青霉ATCC10490对洋地黄毒苷未发生转化反应。用制备型薄层色谱法和柱层析法制备转化产物纯品,得到纯度＞95%的高纯度产物Ⅰ。采用MS、H-NMR、C-NMR、HSQC和HMBC等方法对产物Ⅰ进行结构鉴定,得出产物Ⅰ为3β-[（2-羟基-O-6-脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-（1→4）-O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-（1→4） -O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基）氧代]-14β-羟基-5β-心甾-20（22）烯内酯,是首次得到的一个新化合物。初步确定了新月弯孢霉KA-91对洋地黄毒苷的转化工艺,在孢子接种量为105个/ml、底物投料浓度为0.017%、装液量为60ml/250ml三角瓶、发酵液初始pH值为6.0、发酵温度为28℃、底物添加时间为24h的条件下,转化效率得到明显的提高,产物Ⅰ的转化率达到40.0%,产物Ⅱ的转化率达到11.2%。通过实验建立了一条采用微生物转化法合成强心苷化合物的新途径和新工艺。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 强心药及其分类
• 1.1.1 强心苷类
• 1.1.2 拟交感胺类
• 1.1.3 双吡啶衍生物类
• 1.1.4 腺苷环化酶直接激动剂类
• 1.2 强心苷的性质及应用
• 1.2.1 结构及分类
• 1.2.2 理化性质
• 1.2.3 临床作用
• 1.3 洋地黄毒苷的结构和性质
• 1.4 生物转化的研究进展
• 1.4.1 生物转化的特点
• 1.4.2 生物转化在天然产物结构修饰方面的应用
• 1.4.3 羟基化反应
• 1.5 本课题的研究意义及内容
• 1.5.1 立题依据和意义
• 1.5.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要实验仪器与设备
• 2.1.4 主要培养基与溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物转化反应
• 2.2.2 转化产物的提取
• 2.2.3 三种真菌生长曲线的绘制
• 2.2.4 三种真菌混合溶媒耐受性的测定
• 2.2.5 转化产物的分析方法
• 2.2.6 转化产物的分离纯化
• 2.2.7 转化产物的结构鉴定
• 2.2.8 转化反应条件的优化
• 3 结果与讨论
• 3.1 分析方法的建立
• 3.1.1 展开剂的选择
• 3.1.2 洋地黄毒苷的梯度TLC图谱
• 3.2 三株菌的混合溶媒耐受性
• 3.2.1 新月弯孢霉KA-91的混合溶媒耐受性
• 3.2.2 蓝色梨头霉AC307的混合溶媒耐受性
• 3.2.3 雷斯青霉ATCC10490的混合溶媒耐受性
• 3.3 洋地黄毒苷的转化反应
• 3.3.1 新月弯孢霉KA-91对洋地黄毒苷的转化反应
• 3.3.2 蓝色梨头霉AC307对洋地黄毒苷的转化反应
• 3.3.3 青霉ATCC10490对洋地黄毒苷的转化反应
• 3.4 转化产物的分离提取及纯化
• 3.5 产物的结构鉴定
• 3.6 新月弯孢霉KA-91对洋地黄毒苷转化条件的优化
• 3.6.1 适宜斜面培养时间的确定
• 3.6.2 斜面冷藏时间对转化率的影响
• 3.6.3 孢子接种量对转化的影响
• 3.6.4 底物浓度对转化率的影响
• 3.6.5 通气量对转化率的影响
• 3.6.6 发酵液pH值对转化率的影响
• 3.6.7 培养温度对转化的影响
• 3.6.8 投料时间对转化率的影响
• 3.6.9 葡萄糖浓度对转化的影响
• 3.6.10 洋地黄毒苷转化过程分析
• 4 结论
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢
• 附图