淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus）核酸疫苗的免疫效果评价及安全性研究

论文摘要

随着人们对水产品需求量的增加,水产养殖业得到了快速发展。但大规模高密度养殖造成的水环境污染,致使水产病害日趋严重,特别是病毒性疾病造成的损失更加惊人。淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus, LCDV）,属于虹彩病毒科（Iridoviridae）病毒,是在我国养殖牙鲆、真鲷、大菱鲆、军曹鱼以及野生虾祜鱼等多种鱼中暴发的首例病毒。目前,世界上报道的、可被淋巴囊肿病毒感染的鱼类至少有42科、125种以上,其中海水鱼占30科。继南方养殖石斑鱼中发生淋巴囊肿病以来,1997年山东省荣成市养殖牙鲆也发生了此病,后来迅速蔓延到威海、乳山、青岛等主要养殖区;1998年,河北省唐山、乐亭等也大量发生该病毒病。由于鱼类被感染后,其口唇、鳃、鳍、尾及体表各处会长出大小不一的肿瘤,形象丑陋、活力减弱,有直接或间接的死亡,所以造成的经济损失是严重的。当前,我国海水鱼养殖者大多使用化学合成或抗生素类药物“抵抗”疾病,但由于药物残留、诱变抗药菌株及水体污染等副作用,导致了我国水产品在出口时遇到种种障碍、严重阻碍了经济的发展。近年的研究认为,基因工程疫苗,是在病毒病防治中替代化学药品和抗生素的最好选择。与传统疫苗相比,核酸疫苗具有独特的优势,如生产成本低、可与其他免疫原组成多价疫苗、可诱导机体产生强烈而持久的体液免疫和细胞免疫并具有良好的安全性等。目前,水产养殖界核酸疫苗研究尚处于起步阶段,国外主要集中在鲑、鳟鱼类的IHNV、VHSV、SVCV、SHRV等传染性病毒病的防治上。但迄今未见淋巴囊肿病毒基因工程疫苗的研究报道。本论文对应用分子克隆技术构建的牙鲆淋巴囊肿病毒核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb以及应用生物信息学设计的6种核酸疫苗（pcDNA3.1+/LTE1,2,3和pcDNA3.1+/L29A,B,C）在真核细胞COS7及牙鲆胚胎干细胞（FEC）中的表达定位进行了研究;并在牙鲆体内进行了免疫效果评价;对核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb在牙鲆体内的存留部位、时间及表达、安全性及两种免疫佐剂脂质体和CpG基序的免疫激活作用进行了研究,并初步探讨了其免疫机制。上述研究为淋巴囊肿病毒核酸疫苗的生产应用和产业化

论文目录

• 英文缩写词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 引言
• 第一章 鱼类病毒病的发生与研究概况
• 第二章 水产养殖动物核酸疫苗的研究与应用现状
• 1、核酸疫苗的研究简介
• 2、核酸疫苗在鱼类上的应用
• 3、核酸疫苗对鱼类免疫反应的诱导机制
• 3.1 核酸疫苗诱导的体液免疫
• 3.2 核酸疫苗诱导的细胞免疫
• 4、鱼用核酸疫苗的研制
• 4.1 载体的构建
• 4.2 抗原编码基因筛选
• 5、影响核酸疫苗免疫效果的因素
• 6、DNA 疫苗的安全性及其他相关问题
• 7、鱼用核酸疫苗研究展望
• 第三章 核酸疫苗佐剂的研究进展
• 1、脂质体核酸疫苗佐剂
• 1.1 概念与研究现状
• 1.2 脂质体用作疫苗佐剂的优点
• 1.3 脂质体佐剂疫苗的应用例
• 1.3.1 病毒类脂质体佐剂疫苗
• 1.3.2 细菌类脂质体佐剂疫苗
• 1.3.3 寄生虫脂质体疫苗
• 1.3.4 肿瘤脂质体疫苗
• 1.4 影响脂质体佐剂疫苗效果的因素
• 1.4.1 脂质体的制备
• 1.4.2 疫苗抗原与脂质体的结合方式
• 2、细胞因子、CpG ODN 等新型核酸疫苗佐剂的研究进展
• 2.1 细胞因子
• 2.1.1 IL-2
• 2.1.2 IL-12
• 2.1.3 IL-4
• 2.1.4 IFN-γ
• 2.1.5 GM-CSF
• 2.2 C3d
• 2.3 CpG DNA
• 2.3.1 CpG DNA 的发现
• 2.3.2 CpG DNA 的结构特性
• 2.3.3 CpG DNA 的免疫学作用
• 2.3.4 CpG DNA 的佐剂作用
• 2.4 细胞因子及CpG DNA 在鱼类疾病防治中的应用
• 第四章 核酸疫苗中试产品的质量控制
• 1、原材料的质量控制
• 1.1 对核酸疫苗的质量要求
• 1.2 对工程菌的质量要求
• 2、培养过程中的质量控制
• 3、纯化过程中的质量控制
• 4、最终产品的质量控制
• 第二部分 研究内容
• 第一章 淋巴囊肿病毒中国分离株（LCDV-cn）候选疫苗的制备与细胞内表达、定位研究
• 1、材料
• 2、方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 第二章 重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb 在牙鲆体内存留与表达研究
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 第三章 重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb 的免疫效果评价
• 1、接种重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb 前牙鲆感染LCDV-cn 的检验
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 2、重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP0.6kb 不同接种途径和剂量的免疫效果比较
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第四章 淋巴囊肿病毒核酸疫苗佐剂的研究
• 1、脂质体对牙鲆淋巴囊肿病毒核酸疫苗免疫活性的影响
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 2.C pG ODN 对牙鲆淋巴囊肿病毒核酸疫苗免疫活性的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第五章 免疫接种淋巴囊肿病毒核酸疫苗后牙鲆组织内组织相容性复合体 I、II（MHC Iα、IIα）表达水平的变化
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 第六章 淋巴囊肿病毒核酸疫苗的安全性研究
• 1、淋巴囊肿病毒核酸疫苗的内毒素测定
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 1.3 内毒素检测试验
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 2、肌肉注射淋巴囊肿病毒核酸疫苗后的炎症反应
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 3、疫苗与宿主染色体整合性及对环境抗性菌的影响研究
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第七章 淋巴囊肿病毒核酸疫苗的田间应用
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 博士学位在读期间发表的论文
• 致谢