论文摘要
雄性生殖干细胞（male germ-line stem cells,mGSCs）,也称作精原干细胞（SSCs）,是近年来生物学研究中最活跃、最具有吸引力的领域之一,雄性生殖干细胞的研究在畜牧生产、生物医学等领域具有广泛的应用前景。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）是第一个被发现的调控mGSCs自我更新的生长因子。研究表明,GDNF是调控mGSCs体外自我更新最基础的生长因子,其调控作用具有剂量依赖性。小鼠雄性生殖干细胞系的研究显示,GDNF对mGSCs的自我更新的调控主要通过PI3K/Akt、Ras/Erk1/2、Src家族激酶等信号通路来实现,但对于不同的物种、不同的细胞系,GDNF主要介导的信号通路却不尽相同,同时GDNF对牛、山羊等动物mGSCs增殖的调控是否依赖于这几条信号通路未见报道。本研究检测了不同时期奶山羊睾丸组织中GDNF家族受体的表达情况,进一步分离纯化了奶山羊mGSCs,并对其进行了生殖细胞及多能性细胞特异性表面抗原的检测。然后采用不同浓度梯度的GDNF（0 ng/mL,5 ng/mL,10 ng/mL,20 ng/mL）对奶山羊mGSCs进行培养,筛选出维持奶山羊mGSCs自我更新的最适GDNF浓度。最后通过在含GDNF的奶山羊mGSCs培养液中添加PI3K及MEK的特异性抑制剂,初步筛选出GDNF作用于奶山羊mGSCs的主要信号通路。1. GDNF家族受体GFRa1的表达情况采用RT-PCR及免疫组织化学的手段,对GDNF家族受体GFRa1在胎儿、新生羊、青春期及成年等不同年龄时期奶山羊睾丸组织中的表达进行了研究。RT-PCR结果显示,GFRa1在胎儿期表达比较强,随着年龄的增长其表达量逐渐降低,而免疫组化结果则显示GFRa1仅在成年睾丸组织中表达。这说明GFRa1在奶山羊睾丸组织中有表达,但表达规律可能与小鼠和人的不大相同。2.奶山羊mGSCs的分离纯化及鉴定采用混合酶（胶原酶2 mg/mL,DNA酶20μg/mL,分解酶2 mg/mL）消化奶山羊睾丸组织,比较了纤粘连蛋白差速2 h贴壁细胞及未贴壁细胞的碱性磷酸酶（AP）染色,发现差速2 h未贴壁细胞所形成的克隆AP染色着色较深,且整个克隆着色,而2 h贴壁细胞所形成的克隆呈现部分AP阳性,说明差速2 h未贴壁细胞中mGSCs含量较高。然后对差速2 h未贴壁细胞进行了生殖细胞及多能性细胞表面抗原（GFRa1、CD49f、Stra8、Vasa、TERT、Oct4）免疫荧光染色,发现这些细胞均呈现阳性,说明得到了比较纯的奶山羊mGSCs。3. GDNF最适浓度的筛选采用含不同浓度梯度GDNF（0 ng/mL,5 ng/mL,10 ng/mL,20 ng/mL）的奶山羊mGSCs培养液培养纯化的奶山羊mGSCs,经群体倍增时间、细胞增殖能力（PCNA、BrdU免疫荧光染色）及细胞多能性的表达比较分析表明10 ng/mL GDNF组培养的mGSCs其群体倍增时间较其他各组短,增殖能力明显强,而多能性基因的表达无明显差异,从而确定10 ng/mL的GDNF为维持奶山羊mGSCs自我更新的最适浓度。4. GDNF所介导信号通路研究采用奶山羊mGSCs对照培养液、含10 ng/mL GDNF培养液、含10 ng/mL GDNF+10μmol/L PI3K抑制剂及含10 ng/mL GDNF+10μmol/L MEK抑制剂的培养液培养纯化的奶山羊mGSCs,经群体倍增时间、细胞增殖能力、多能性基因的表达以及通过RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blotting及细胞周期检测等分析表明,GDNF可通过PI3K/Akt及MEK/ERK1/2两条信号通路调控奶山羊mGSCs自我更新,且发现GDNF可能主要通过PI3K/Akt信号通路起作用。