结核分枝杆菌H37Rv色氨酸合成酶α和β亚基的酶学性质及结构分析

论文摘要

结核病是全球死亡率和发病率最高的传染性疾病之一,每年可以引起8百万人感染,导致2.5—3百万人死亡。结核分枝杆菌是引起人类结核病的致病菌。全球耐多药结核菌的出现和蔓延,对发展新型的抗结核药物提出了迫切需求。色氨酸合成途径不存在于哺乳动物中。然而,对于藻类、细菌、真菌和高等植物,它们必须自行合成色氨酸。结核杆菌的色氨酸营养缺陷型菌株不能在巨噬细胞里繁殖和存活,证明该代谢途径对结核杆菌的存活至关重要。这种高度选择性使得色氨酸合成途径中的酶成为可能的开发有效抗结核药物的药靶。色氨酸生物合成途径是从分支酸起始的五步连续反应。色氨酸合成酶（TSase）催化色氨酸合成途径中的最后两步反应。色氨酸合成酶是具有αββα亚基结构的异质四聚体,其中α,β亚基分别由trpA和trpB基因编码。β亚基酶蛋白以吲哚和L-丝氨酸为底物,酶促合成L-色氨酸。其中,PLP（pyridoxal-5’-phosphate）是辅因子。本论文克隆了色氨酸合成酶α和β亚基的编码基因Rv1613和Rv1612（即trpA和trpB）,然后在大肠杆菌中BL21（DE3）得到表达,通过亲和纯化获得高纯的重组蛋白,SDS-PAGE和质谱结果显示它们的MW分别为33151.0u和50224.0u（含载体蛋白）,证实确为重组目的蛋白。通过优化实验,得到β亚基酶反应最佳条件为:0.15MNa+或0.18M Mg2+,PH7.5,温度37℃,His-rMtTRPSA与His-rMtTRPSB的摩尔比为2.2。同时,也证实了色氨酸合成酶α亚基可以促进β亚基酶活反应。在此反应条件下,色氨酸合成酶β亚基对底物吲哚,L-丝氨酸和PLP的Km值分别为0.288mM,0.178mM和20.824Mm。通过圆二色仪获得色氨酸合成酶α和β亚基的二级结构,再采用同源模建方法建立了两亚基的结构模型,结构比较预测色氨酸合成酶β亚基中PLP的结合位点（活性中心）为Ser390,Ser99,Gln128,Ser249,Asn250,Glu364,Thr204,His100。对这些位点定点突变,酶活下降明显,验证了计算机结构模拟的可靠性。本研究完成了结核分枝杆菌色氨酸合成酶α和β亚基的克隆、表达和纯化,建立了酶学活性检测方法,并鉴定了可能的催化活性位点。这些工作的开展,对设计和筛选针对该酶的抑制剂,最终用于开发抗结核药物奠定了基础,同时也为蛋白相互作用模型提供实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 第一节 结核病的概况
• 1.1.1 结核病现状
• 1.1.2 结核病治疗面临的问题
• 参考文献
• 第二节 抗结核药物靶标的探索
• 1.2.1 新型抗结核药靶的研究进展
• 1.2.2 基于生物信息学的抗结核药靶的发现
• 1.2.3 结语
• 参考文献
• 第二章 结核分枝杆菌H37RV的色氨酸合成酶ALPHA和BETA亚基的酶学性质及结构分析
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 参考文献
• 第三节 结果与讨论
• 2.3.1 结核分枝杆菌TRPSA和TRPSB的进化分析
• 2.3.2 Rv1613和Rv1612基因的克隆和表达载体的构建
• 2.3.3 重组结核分枝杆菌TRPSA和TRPSB在大肠杆菌BL21中的表达
• 2.3.4 高表达重组结核分枝杆菌TRPSA和TRPSB蛋白的亲和纯化
• 2.3.5 HPLC分析和质谱鉴定
• 2.3.6 重组蛋白TRPSA和TRPSB的生物物理分析
• 2.3.7 重组结核分枝杆菌TRPSB的酶学性质分析
• 2.3.8 重组结核分枝杆菌TRPSA和TRPSB的三维模建和催化位点分析
• 2.3.9 总结
• 硕士期间发表的论
• 致谢