论文题目: 不借助于显微操作仪的小鼠体细胞核移植技术研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 马所峰
导师: 谭景和
关键词: 小鼠,秋水仙胺,诱导去核,细胞周期,冷冻保存,氯化锶,卵母细胞激活,无透明带卵母细胞核移植,体细胞核移植
文献来源: 山东农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 小鼠体细胞核移植不仅是发育、遗传等基础研究的重要手段,而且对于克隆基础理论研究也具有不可比拟的重要性。本研究的目的是发展和完善一种不依赖于显微操作仪的小鼠体细胞核移植程序,同时完善常规的小鼠体细胞核移植程序,以期降低小鼠核移植操作难度并提高其效率。这种不依赖于显微操作仪的小鼠体细胞核移植程序涉及到供体细胞培养和选择、重构胚的激活、胚胎的体外培养和移植等问题,这些问题与常规的体细胞核移植程序有可以互相借鉴的地方,也有特殊的地方,比如无透明带(重构)胚胎的体外培养和胚胎移植等。开展本项研究对于克隆基础理论研究有重要意义,而且有可能在某种程度上提高小鼠体细胞克隆效率。实验主要结果如下: 1. 制备具发育潜力的去核卵母细胞是决定克隆动物成功与否的关键因素。我们以昆明小鼠卵母细胞为实验材料,对影响秋水仙胺(demecolcine, Deme) 诱导去核效率的几个因素(包括Deme 处理起始时间和作用时间、Deme 浓度、激活后卵母细胞培养时间和卵母细胞的卵龄) 进行实验。结果表明:(1) 使用0.4 μg/ml Deme 诱导去核时,乙醇激活后立即开始Deme 处理,处理时间为45 min 时可以得到最高的去核率(29.7%);(2)延长激活后培养时间不能增加Deme 诱导去核率,Deme 的作用是可逆的;(3) Deme 浓度影响诱导去核率,卵母细胞乙醇处理后立即用含0.6 μg/ml Deme的CZB处理45 min是可以获得最高的去核率(33.4%);(4)注射hCG 后18h 的卵母细胞更有利于Deme 诱导去核。总之,昆明小鼠Deme 诱导去核最佳条件为:注射hCG后18h 卵母细胞用7% (v/v) 乙醇处理7 min后马上用0.6 μg/ml Deme处理45min(去核率32.0%)。2. 供体核与受体胞质细胞周期同步与否是影响克隆胚胎发育的重要因素之一。我们培养传代了小鼠耳成纤维细胞,并检测了不同细胞周期同步化方法处理对其细胞周期的影响。同时,为了保存用于核移植实验的体细胞种质资源,我们初步建立了一种体细胞微量冷冻保存体系。结果表明,第1-7 代细胞的细胞周期分布和细胞凋亡比率没有显著差异。细胞贴满程度和细胞接触抑制时间都影响细胞周期分布及细胞凋亡比率。70-80%贴满的细胞比较适合于用血清饥饿方法同步化细胞周期到G0/G1 期。使用13.5μM demecolcine 处理14 h 是比较好的小鼠耳皮肤成纤维细胞G2/M 期同步化方法。在保存时间不超过180 天时,微量冷冻保存不降低细胞存活率。微量冷冻保存对处于不同细
论文目录:
缩略语表
中文摘要
English Abstract
第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展
1. 细胞核移植技术研究的历史
2. 细胞核移植的方法
3. 克隆技术中亟待解决的问题
4. 核移植技术的应用
5. 小鼠体细胞克隆相关问题的研究进展
6. 本研究的目的及主要内容
第二章 小鼠卵母细胞秋水仙胺诱导去核的研究
1. 引言
2. 材料方法
3. 结果
4. 讨论
第三章 小鼠皮肤成纤维细胞的细胞周期调控及微量冷冻保存
1. 引言
2. 材料方法
3. 结果
4. 讨论
第四章 小鼠卵母细胞氯化锶激活最佳条件的研究
1. 引言
2. 材料方法
3. 结果
4. 讨论
第五章 小鼠去透明带胚胎的培养
1. 引言
2. 材料方法
3. 结果
4. 讨论
第六章 不借助于显微操作仪的小鼠体细胞核移植
1. 引言
2. 材料方法
3. 结果
4. 讨论
第七章 卵母细胞品系及供核体细胞类型对小鼠核移植重构胚发育的影响
1. 引言
2. 材料方法
3. 结果
4. 讨论
结论
参考文献
图版
作者简介及攻读博士学位期间发表的学术论文
致谢
发布时间: 2005-10-11
参考文献
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