甜瓜ACO1启动子的组织特异调控研究

论文摘要

提高果实耐贮运性的研究一直是甜瓜育种的重要目标,更是生产上亟待解决的难题。近年来的研究表明利用基因工程技术可延迟果实成熟,获得了一系列转基因植株,但研究中大多数采用组成型启动子,在其控制之下,外源基因在转基因植物中的表达可维持一个恒定水平。这种外源基因在受体植物中的非特异性的持续高效表达不但造成无谓的能量浪费,而且还会在需要该基因大量表达的时间或特异组织部位则因表达量过低而达不到预期效果。因此,在植物转基因研究中,选择诱导性或组织特异性表达启动子则可大大提高外源基因表达的效果,减少能量和物质的消耗,增加表达的产物量。使转基因植物中外源基因的表达量以及时空特征都受到调控,以适应不同的需要。本研究针对甜瓜转ACC氧化酶反义基因中使用35S组成型启动子,在已克隆出的CM-ACO1果实特异性启动子的基础上,做了以下研究:1.植物表达载体的构建策略:用限制性内切酶HindⅢ与BamHⅠ分别对双元载体pBI101.2和质粒pCM-ACO1-promoter进行消化,回收pBI101.2线状载体和886bp的启动子片段。由于在启动子两端有人工设计合成的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,经上述双酶切消化后,回收目的基因片段与线状载体的粘性接头恰好匹配。经过连接、转化和菌落筛选鉴定,证明启动子已正向插入到GUS基因的前面,从而构建了带有nptⅡ选择标记基因的植物表达载体pCAPG101.2。2.用冻融法将GUS与启动子融合的植物表达载体pCAPG101.2直接导入根癌农杆菌EHA105菌株中,用抗生素抗性筛选和PCR方法证实pCAPG101.2已导入农杆菌。采用根癌农杆菌介导法转化烟草,进一步验证了载体的可行性。3.对甜瓜栽培品种的转化采用已优化好的转化体系:农杆菌菌液OD560=0.3,侵染时间为15min,外植体选用近轴端子叶;共培养时间为72h。确定了选择分化培养基为MS+1mg/L 6-BA+ 500mg/L Carb+ 75mg/L Kana;伸长培养基MS+0.05mg/L 6-BA+ 300mg/L Carb+ 75mg/L Kana;生根培养基为1/2MS+ 200mg/L Cef + 25mg/L Kana。共转化2000个外植体,得到14株具有Kana抗性、PCR检测呈阳性的转化株系。4.对获得的转化株系在不同生长阶段取根、茎、叶、花、果实等组织进行X-Gluc染色,结果表明只有花药组织和后熟果实的果皮组织有蓝色,其余组织均没有检测到GUS基因的表达,说明甜瓜CM-ACO1启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药组织和后熟果实的果皮组织特异表达。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• Ⅰ 文献综述
• 1. 植物果实软化的基因工程
• 1.1 ACC 合成酶基因（ACS）
• 1.2 ACC 氧化酶基因
• 1.3 多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因
• 2. 植物基因表达调控
• 3. 植物启动子研究进展
• 4. 组织特异性启动子
• 5. GUS 染色技术的应用
• 6. 甜瓜基因工程
• 7. 甜瓜ACC 氧化酶基因的研究
• 8. 本研究的目的意义
• 9. 技术路线
• Ⅱ 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种与质粒
• 1.3 药品与试剂
• 1.4 培养基
• 1.5 缓冲液
• 2. 方法
• 2.1 质粒 DNA 的提取
• 2.2 酶切
• 2.3 采用低熔点琼脂糖凝胶法（Sambrook J.1996）回收目的片段
• 2.4 大片段去磷酸化
• 2.5 回收片段与 Vector 的连接反应
• 2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.7 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.8 PCR 扩增
• 2.9 根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法
• 2.10 根癌农杆菌介导的甜瓜叶盘转化法
• 2.11 GUS 组织化学染色法
• Ⅲ 结果与分析
• 1. 植物表达载体的构建
• 1.1 pCAM-ACO1-promoter 和pBI101.2 酶切鉴定
• 1.2 重组质粒的鉴定
• 2. 植物转化载体的构建
• 3. 烟草转化
• 3.1 Kana 抗性芽的筛选
• 3.2 Kana 抗性苗的筛选
• 3.3 烟草抗性苗的 PCR 检测
• 3.4 转基因烟草的温室培育
• 4. 转基因甜瓜的获得
• 4.1 甜瓜 Kana 抗性芽的获得
• 4.2 甜瓜抗性苗获得
• 4.3 甜瓜转化植株的 PCR 检测
• 4.4 转基因甜瓜的温室培育
• 5. GUS 基因表达检测
• 5.1 转基因烟草和甜瓜的瞬时表达检测
• 5.2 转基因甜瓜的组织特异性表达检测
• Ⅵ 讨论
• 1. 载体构建
• 2. 植物转化载体的构建及检测
• 3. 甜瓜的遗传转化
• 3.1 细胞分裂素与抗生素之间的相互影响
• 3.2 转化植物体内农杆菌的影响
• 3.3 导入基因的整合问题
• 4. 植物选择标记基因
• 5. 甜瓜ACO1 启动子的特异调控
• Ⅴ 结论
• Ⅵ 参考文献
• Ⅶ 图版
• 主要英文缩略词表
• 致谢
• 个人简历
• 导师简介