论文摘要
大豆卵磷脂（PC）广泛应用于食品、医药、化妆品、农产品等行业，近年来对卵磷脂的酶法改性研究较多。本文利用磷脂酶在非水介质中催化卵磷脂水解生成甘油磷酸胆碱（GPC），对其反应体系的构建、产物初步分离纯化及分析方法的建立、制备工艺的优化、有机溶媒的回收、反应机理及酶的固定化进行了探索性研究。论文首先以底物PC为表面活性剂，己醇为助表面活性剂，庚烷为油相，醋酸盐缓冲液为水相构建W/O型微乳体系，初步确定的微乳液的构成为：PC：庚烷：己醇：水相=1:6.3:0.9:0.5，其中PC为质量单位（g），其它为体积单位（mL）。在此反应体系中以磷脂酶为催化剂做催化反应，酸碱滴定法判断反应终点。反应结束后反应液经初步的分离纯化——萃取后，分别以TLC法和HPLC法对GPC粗品做定性和定量检测，此时GPC产率为85%。其次，对酶法制备GPC的工艺进行了优化。最适温度40℃；最适pH5.0；Ca2+对产物的产量没影响；补加底物前，酶与缓冲液的体积比为1:2；初始反应底物浓度为0.278g/mL，即此时初始反应体系变为：PC:庚烷:己醇:水相=2:6.3:0.9:0.5；补加底物浓度为0.437g/mL；补加质量为初始质量的一半；补加底物的同时要补充适量水相缓冲液，缓冲液的量按PC:庚烷:己醇:水相=1:2:0.286:0.25计算；补加时间为反应后1.5h；反应总时间为6h；实行补加工艺后，GPC产率增长到96.5%。采用将反应液先旋蒸后萃取的方法使反应试剂与萃取剂分离，分别回收。其中萃取剂二氯甲烷、甲醇/水可通过旋蒸回收，反应试剂庚烷和己醇利用气相色谱外标定量法测出体积比，然后配成原比例7:1，重新用于下一批反应。在磷脂酶催化水解PC制备GPC的过程中，通过TLC法证实了反应过程中确有中间产物LPC的生成，通过酰基转移反应最终转化为GPC。论文最后对磷脂酶的固定化进行了研究。通过比较戊二醛交联法、吸附包埋法、吸附法三种方法制备的固定化酶催化制备GPC的研究，发现吸附法制备的固定化酶催化效果较好。然后研究了硅藻土、阳离子交换树脂001*7（732）、Seplite树脂LX-1000EP、Seplite树脂LX-1000NHF四种载体的吸附固定化效果。其中LX-1000NHF载体制备的固定化酶催化反应时间稍短，产物产量较高。其固定化条件为：载体与酶量比为5:2（m/v），吸附时间5h，吸附温度为室温；固定化酶与游离酶的Km值分别为0.705g/mL和0.184g/mL；以5g底物为例，固定化酶制备GPC的最适加酶量为3g，最适温度60℃，最适水含量2mL。其中前2批的产率比游离酶（85%）的高，分别是98.6%、87.6%。本研究为甘油磷酸胆碱的制备提供了一种可行的方法，为其产业化应用奠定了基础，为卵磷脂的酶法改性研究提供了可靠的理论依据。