丹参EST-SSR和cpSSR分子标记的建立及其遗传特征分析

论文摘要

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎,为大宗药材,主产于山东、河南、四川、山西、河北、江苏、安徽等省。具有活血通络、祛淤止痛、凉血消痈、清心除烦等功效。已有的研究表明,丹参在形态特征、化学特征和分子遗传等方面存在丰富的多样性。其药用历史悠久,其道地产区也几经变换,其种质的交流必然是复杂的,特别是近年来随着丹参需求的猛烈增长,药农从各地引种丹参,这势必对丹参品质产生影响。为了解各个主产区栽培丹参的遗传背景,我们采用EST-SSR和cpSSR分子标记对丹参进行了遗传多样性研究和遗传特征分析。首先,从美国生物信息中心（NCBI）数据库GeneBank中下载丹参EST序列10228条,对其进行SSR信息分析。发掘含有SSR位点的EST序列1790条,占丹参EST序列的17.5%，丹参SSR位点共2014个,其中205条EST序列含有2个以上SSR位点,丹参SSR位点出现频率为19.69%。设计EST-SSR引物104对,合成其中25对用于EST-SSR分析的引物筛选。通过文献查阅筛选出20对通用率较高的cpSSR引物用于cpSSR分析的引物筛选。以此,首次建立了适合丹参的EST-SSR和cpSSR分子标记技术体系。其次,选择9对EST-SSR和12对cpSSR扩增良好、重复性好、条带清晰SSR引物,首次对全国8省25县31个采样点丹参进行EST-SSR和cpSSR检测分析。结果表明,丹参在细胞核遗传（EST-SSR）和细胞质遗传（cpSSR）上,总体均体现为中等水平。然而在地区上存在不同程度差异。基于Shannon多样性指数和Nei’s基因多样性指数的细胞核遗传多样性,各省区间的大小依次为：山东、河南、四川、山西、江苏、安徽、陕西、河北；而细胞质遗传多样性各省间大小依次为：山西、河南、山东、河北、四川、江苏、陕西、安徽。EST-SSR（细胞核遗传）和cpSSR（细胞质遗传）所揭示的丹参8各省区间的遗传变异均以种群间的遗传变异为主导。结果分析表明,各省区内种群间的基因流有限,省区间的基因交流比较明显。在细胞核遗传中,山东与河南两省之间的基因交流最大,Nm值达到19.6381；山东、河南两省与其余各省均有基因交流；四川与山西、江苏、山东、河南、安徽5省有明显基因交流；江苏、山西、河北、陕西之间交流有限。在细胞质遗传中山东与河南、山东与四川之间有明显的基因交流,分别为8.8926、8.2068；江苏与山东、四川、河南、河北也存在基因交流；陕西与山东、河南有基因交流：山西仅与河南有一定基因交流；安徽与其余7省之间基因交流有限。最后,通过叶绿体遗传的分析表明,道地产区和传统主产区的丹参主要为就地引种开始栽培,在栽培过程中引种了部分外来种源,在道地产区四川、山东、河南之间很早就存在种质互换；新产区多为道地产区引种的种源。同时对全国8省25县31个采样点丹参的遗传多样性分析表明,丹参存在丰富种质多样性,为丹参的品种保育工作提供了实验支撑。但在遗传分化上却没有地理相关性,进一步说明全国丹参种质之间存在广泛的基因交流,是由于人类活动中对丹参的异地引种所造成。为保护丹参所具有的遗传多样性,应尽量避免大规模的异地引种,尤其应保护道地产区的种质特性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 药用植物遗传多样性研究的意义
• 1.1.1 生物多样性与中药品质
• 1.1.2 药用植物遗传多样性对中药品质的影响
• 1.1.3 药用植物遗传多样性的研究意义
• 1.2 药用植物遗传多样性研究的方法
• 1.2.1 形态学标记
• 1.2.2 细胞学标记
• 1.2.3 生化标记
• 1.2.4 DNA分子标记技术
• 1.2.4.1 RFLP
• 1.2.4.2 RAPD
• 1.2.4.3 AFLP
• 1.2.4.4 SSR
• 1.2.4.5 SNP
• 1.2.5 EST-SSR标记的应用概况
• 1.2.6 cpSSR标记的应用概况
• 1.3 丹参的遗传多样性研究概况
• 1.3.1 丹参药用历史及资源概况
• 1.3.2 形态特征研究
• 1.3.3 化学特征的研究
• 1.3.4 分子生物学研究
• 1.4 研究目的意义
• 1.5 研究目标和意义
• 1.6 研究内容
• 1.7 技术路线
• 2 试验材料与仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂与仪器
• 3 EST-SSR分析
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 EST-SSR引物的开发与设计
• 3.1.2 丹参总DNA提取
• 3 .1.3 SSR技术的优化建立
• 3.1.4 EST-SSR引物的筛选
• 3.1.5 数据统计与分析方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 丹参EST序列中SSR信息的分析
• 3.2.2 丹参EST-SSR扩增的位点分析
• 3.2.3 丹参遗传多样性
• 3.2.4 丹参遗传结构
• 3.2.5 群体间遗传距离与遗传一致度
• 3.2.6 亲缘关系聚类分析
• 3.2.7 群体遗传距离和地理距离相关性分析
• 4 cpSSR分析
• 4.1 试验方法
• 4.1.1 cpSSR引物获得与评价
• 4.1.2 丹参叶绿体基因组DNA提取
• 4.1.3 cpSSR引物的筛选
• 4.1.4 数据统计与分析方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 丹参cpSSR扩增位点分析
• 4.2.2 丹参遗传多样性
• 4.2.3 丹参遗传结构
• 4.2.4 群体间遗传距离与遗传一致度
• 4.2.5 亲缘关系聚类分析
• 4.2.6 群体遗传距离和地理距离相关性分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 丹参EST-SSR标记的可行性
• 5.2 cPSSR引物的通用性
• 5.3 影响SSR技术的关键问题
• 5.4 丹参种群的遗传多样性
• 5.5 丹参种群遗传分化
• 5.6 丹参栽培品的种源探讨
• 5.7 丹参遗传多样性的保护对策
• 5.8 存在问题分析
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果